發(fā)布時(shí)間：2017-07-20 03:04

  本文關(guān)鍵詞：T-Synthase對卵巢上皮性癌中相關(guān)TCAC表達(dá)的影響及相關(guān)功能研究

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【摘要】：研究背景卵巢癌是女性生殖器官常見腫瘤之一,病死率幾乎占婦科腫瘤之首,對婦女的生命造成嚴(yán)重威脅。由于卵巢癌具有起病隱匿、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn),大約3/4的患者就診時(shí)已屬晚期。手術(shù)治療聯(lián)合化療能一定的延長患者生存期,但卵巢癌的死亡率和復(fù)發(fā)率仍然較高,五年生存率仍然較低,因此,臨床上迫切需要新的能用于卵巢癌早期診斷和治療的分子標(biāo)志物,尋找新的卵巢癌相關(guān)分子是目前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。目前,臨床上診斷癌癥主要依賴于影像,生物標(biāo)志物,臨床分期以及其他的一些病理學(xué)分析,細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)生改變被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的標(biāo)志�，F(xiàn)在人們普遍認(rèn)識到蛋白質(zhì)和脂類的糖基化發(fā)生改變也可以作為腫瘤發(fā)生的標(biāo)志,如CA-125,Tn和Sialyl Tn,它們都是糖基化蛋白,經(jīng)常作為生物學(xué)標(biāo)志物來診斷癌癥。其中,Tn抗原是一種腫瘤相關(guān)碳水化合物抗原,通常不在外圍的組織和血細(xì)胞中表達(dá),但是卻在人類各種類型的癌細(xì)胞中表達(dá),Tn抗原主要來源于一個(gè)正常的O-糖基化通路,即聚糖從共同的前體GalNAcα1-O-絲氨酸/蘇氨酸擴(kuò)展受到阻塞。該前體是在高爾基體中由一個(gè)家族多肽的產(chǎn)生的α-N-乙酰氨基半乳糖(ppGalNAcTs)糖蛋白,然后延伸到由單個(gè)酶稱為T合酶(核心1β3半乳糖或C1GalT)組成的共同的核心O聚糖galβ1-3galnacα1-oser/蘇氨酸(t抗原)。形成的t-合酶活性形式需要獨(dú)特的分子伴侶稱為cosmc,該cosmc(xq24在人類,xc3小鼠)在x染色體上編碼。cosmc駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er),并防止錯(cuò)誤折疊,聚集新合成的t-合酶,防止蛋白酶體的降解�；钚缘膖-合酶或cosmc的表達(dá)缺失可導(dǎo)致tn抗原的表達(dá),以及影響它的唾液酸化的唾液酸t(yī)n抗原在大多數(shù)腫瘤中表達(dá)。目前關(guān)于腫瘤相關(guān)性碳水化合物抗原在卵巢癌中的研究尚不多見,t-synthase,t,tn和s-tn在卵巢癌以及正常卵巢組織中的表達(dá)情況如何,它們定位于何處,以及它們與分子伴侶cosmc基因有何密切的關(guān)系,它們在腫瘤的形成過程中起著什么關(guān)鍵性的作用,這都有待我們通過實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行研究。目的1.明確t-synthase、t、tn和s-tn抗原在卵巢上皮性癌組織及正常卵巢組織中的表達(dá)及分布;2.明確t-synthase、t、tn和s-tn抗原在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá);3.明確不同表達(dá)狀態(tài)下的cosmc在卵巢癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。方法1.收集卵巢上皮性癌組織切片和卵巢上皮性癌新鮮組織,通過免疫組織化學(xué)和westernblot的方法檢測卵巢上皮性癌組織和正常卵巢組織中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的分布和表達(dá);2.通過培養(yǎng)兩種卵巢癌細(xì)胞系,制作細(xì)胞爬片,運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測卵巢癌細(xì)胞中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的分布和表達(dá),同時(shí),運(yùn)用westernblot的方法檢測卵巢癌細(xì)胞系中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的表達(dá)情況;3.構(gòu)建cosmc過表達(dá)慢病毒載體,轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后,通過westernblot的方法檢測細(xì)胞系中t-synthase、t、tn和s-tn抗原分子表達(dá)的變化,闡明t-synthase唯一分子伴侶cosmc表達(dá)的高低對tcac表達(dá)的影響,然后,通過mtt法和流式細(xì)胞儀檢測cosmc表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞生長和凋亡的影響,運(yùn)用transwell實(shí)驗(yàn)檢測cosmc表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果1.正常卵巢組織和卵巢上皮性癌組織中t-synthase、t、tn、s-tn抗原的表達(dá)。運(yùn)用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)對60例癌組織和20例正常組織進(jìn)行t-synthase、t、tn、s-tn抗原表達(dá)的檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),t-synthase主要定位于細(xì)胞質(zhì),其在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)較正常組織明顯下調(diào);t抗原主要定位于腺腔表面和外周細(xì)胞表面,其在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)較正常組織明顯下降;tn抗原主要存在于胞漿內(nèi),其在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)較正常組織明顯增高;s-tn抗原主要定位于胞漿內(nèi),在卵巢上皮性癌組織中,s-tn抗原的表達(dá)較正常組織明顯上升。westernblotting實(shí)驗(yàn)對20例新鮮正常卵巢組織與48例卵巢上皮性癌組織樣本進(jìn)行t-synthase、t、tn、s-tn抗原表達(dá)的檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在卵巢上皮性癌組織中t-synthase和t抗原的表達(dá)較正常組織明顯下調(diào),而tn、s-tn的表達(dá)在卵巢上皮性癌組織中較正常組織上升明顯,此結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。2.卵巢癌細(xì)胞系skov3和a2780中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)對卵巢癌細(xì)胞系skov3和a2780細(xì)胞爬片中t-synthase、t、tn和s-tn抗原的表達(dá)進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,t-synthase、t抗原在skov3和a2780細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá),而tn和s-tn抗原在skov3和a2780細(xì)胞中出現(xiàn)中度表達(dá)或高表達(dá),且s-tn比tn的陽性率和敏感性更高。westernblotting檢測卵巢癌細(xì)胞skov3、a2780中cosmc、t-synthase、t、tn和s-tn抗原的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,cosmc、t-synthase、t抗原表達(dá)在卵巢癌細(xì)胞中均不高,而tn和s-tn抗原在skov3、a2780細(xì)胞呈高表達(dá),此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致,表明t-synthase活性的降低抑制了t抗原的表達(dá)。3.cosmc過表達(dá)對相關(guān)分子表達(dá)的影響以及其在卵巢癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。卵巢癌細(xì)胞a2780和skov3培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)染cosmc慢病毒,熒光顯微鏡下測轉(zhuǎn)染效率,熒光強(qiáng)度高,轉(zhuǎn)染效果在80%以上。同時(shí),采用westernblot檢測cosmc的表達(dá),轉(zhuǎn)染cosmc慢病毒的細(xì)胞組較轉(zhuǎn)染空白對照的細(xì)胞,cosmc的表達(dá)量明顯增加,且提高量大于2倍。通過westernblot檢測cosmc過表達(dá)后,t-synthase、t、tn、s-tn抗原的表達(dá)的變化,其結(jié)果表明,過表達(dá)cosmc后,其分子伴侶t-synthase的表達(dá)顯著上升,且T抗原的表達(dá)也相應(yīng)增加,而相應(yīng)的Tn和S-Tn抗原的表達(dá)則受到抑制,表明Cosmc可通過上調(diào)T-Synthase從而促進(jìn)T抗原的形成,并抑制Tn和S-Tn抗原的表達(dá)。通過流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染Cosmc慢病毒的Skov3和A2780細(xì)胞的凋亡數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Cosmc過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞Skov3+和A2780+的凋亡數(shù)較對照組細(xì)胞Skov3和A2780明顯增加,通過MTT法檢測Cosmc對卵巢癌細(xì)胞生長能力的影響,結(jié)果表明,過表達(dá)Cosmc的細(xì)胞其生長能力明顯下降,此結(jié)果表明Cosmc過表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡并抑制其生長。通過分別對轉(zhuǎn)染Cosmc慢病毒的Skov3+和A2780+細(xì)胞進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn),以檢測Cosmc對卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染Cosmc的細(xì)胞穿過小室膜的數(shù)量比對照組明顯減少,Cosmc過表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)論1.T-Synthase、T抗原在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)較正常卵巢組織明顯下降,且在卵巢癌細(xì)胞系中呈低表達(dá)或不表達(dá);Tn和S-Tn抗原在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)較正常卵巢組織明顯上升,且在卵巢癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)。2.卵巢癌細(xì)胞系中過表達(dá)Cosmc基因可促進(jìn)T-Synthase、T抗原的表達(dá),且能抑制卵巢癌細(xì)胞的生長和侵襲及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：卵巢上皮性癌 腫瘤抗原 Cosmc T-Synthase
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-22
• 第一部分T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原在卵巢上皮性癌及正常卵巢組織中的表達(dá)分布22-37
• 1 材料22-26
• 2 方法26-29
• 3 結(jié)果29-35
• 4 討論35-37
• 第二部分T-Synthase、T、Tn和S-Tn抗原在卵巢癌 細(xì)胞系中的表達(dá)分布37-46
• 1 材料37-38
• 2 方法38-42
• 3 結(jié)果42-44
• 4 討論44-46
• 第三部分 不同表達(dá)狀態(tài)下Cosmc的生物學(xué)功能及與 卵巢癌細(xì)胞系中相關(guān)TCAC表達(dá)的相關(guān)性分析46-57
• 1 材料46-47
• 2 方法47-49
• 3 結(jié)果49-54
• 4 討論54-57
• 小結(jié)57-58
• 參考文獻(xiàn)58-66
• 個(gè)人簡歷和研究成果66-67
• 致謝67

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1 邸曼;T-Synthase對卵巢上皮性癌中相關(guān)TCAC表達(dá)的影響及相關(guān)功能研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

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本文編號：565953