本文關鍵詞：MicroRNAs調(diào)控胸部腫瘤中PLK1、BMI1和DAB2基因的分子機制及生物學功能的研究

  更多相關文章： mi RNAs 非小細胞肺癌 食管癌 PLK1 BMI1 DAB2

【摘要】：目的:肺癌和食管癌目前成為胸部腫瘤研究的熱點,在我國的發(fā)病率一直居高不下,尤其是近年來肺癌的發(fā)病率增長速度急劇增加,其中非小細胞肺癌(NSCLC)占85%以上。食管癌是原發(fā)于食管的惡性腫瘤,主要以食管鱗癌(ESCC)為主。肺癌與食管癌早期癥狀不明顯,絕大多數(shù)患者就診時已是中晚期,所以缺乏早期的診斷標記物是目前肺癌和食管癌高死亡率的主要原因。Polo樣激酶1(Polo-like kinase1,PLK1)是一種細胞周期調(diào)節(jié)分子,在有絲分裂過程中起重要作用。BMI1作為多梳基因家族的一種關鍵癌基因,參與細胞的自我更新和增殖,對調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和促進腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要作用。DAB2蛋白是一種廣泛表達的細胞內(nèi)吞適配器,在多種細胞信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮主要作用,DAB2在多種癌癥中表達下降或缺失,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。Micro RNAs(mi RNAs)是一類短鏈非編碼RNAs,通過對基因轉(zhuǎn)錄后抑制調(diào)節(jié)基因的表達。許多研究表明mi RNAs在非小細胞肺癌(NSCLC)和食管鱗癌(ESCC)中表達異常并在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。本課題旨在探討胸部腫瘤中PLK1、BMI1和DAB2異常表達的mi RNAs調(diào)控機制,為胸部腫瘤的早期診斷和治療提供確鑿的實驗依據(jù)。方法:一.在非小細胞肺癌中mi R-296-5p通過靶向調(diào)控PLK1抑制細胞增殖1.運用生物信息學方法預測及驗證具有靶向調(diào)控PLK1的mirco RNAs通過生物信息學軟件Target Scan、Pic Tar和mir Base對直接調(diào)控PLK1的II mirco RNAs進行預測。查找mi R-296-5p的成熟體序列并合成mi R-296-5p的模擬體mimics瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞,利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后PLK1蛋白表達變化。預先將mi R-296-5p mimics和含PLK1-3’UTR的雙熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染NSCLC細胞,運用雙熒光素酶活性實驗檢測mi R-296-5p是否與PLK1 3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。2.mi R-296-5p通過靶向調(diào)控PLK1影響NSCLC細胞的生物學功能用實時熒光定量PCR(q PCR)的方法檢測臨床病人NSCLC組織和癌旁組織中PLK1 m RNA和mi R-296-5p的相對表達量。選取人正常支氣管上皮細胞HBE和5株肺癌細胞(A549、95C、95D、LTEP-α-2和H1299)用Western blot的方法檢測PLK1的蛋白表達水平,同時用q PCR方法檢測mi R-296-5p的相對表達量。用mi R-296-5p mimics和PLK1-si RNA分別轉(zhuǎn)染NSCLC細胞,通過CCK-8和Ed U方法檢測上述基因?qū)SCLC細胞增殖的影響;二.在非小細胞肺癌中mi R-203通過靶向調(diào)控BMI1抑制細胞增殖和侵襲1.運用生物信息學方法預測及驗證具有靶向調(diào)控BMI1的mirco RNAs通過生物信息學軟件Target Scan、Pic Tar和mir Base對直接調(diào)控BMI1的mirco RNAs進行預測。查找mi R-203的成熟體序列并合成mi R-203的模擬體mimics瞬時轉(zhuǎn)染LTEP-α-2細胞,利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后BMI1蛋白表達變化。運用雙熒光素酶活性實驗檢測mi R-203是否與BMI1 3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。2.mi R-203通過靶向調(diào)控BMI1影響NSCLC細胞的生物學功能用實時熒光定量PCR(q PCR)的方法檢測臨床病人NSCLC組織和癌旁組織中BMI1m RNA和mi R-203的相對表達量。選取人正常支氣管上皮細胞HBE和6株肺癌細胞(A549、H1650、H226、H1299、H460和LTEP-α-2)用Western blot的方法檢測BMI1的蛋白表達水平。用mi R-203 mimics和BMI1-si RNA分別轉(zhuǎn)染NSCLC細胞,通過CCK-8和Ed U方法檢測上述基因?qū)SCLC細胞增殖的影響。用Transwell試驗檢測mi R-203和BMI1對NSCLC細胞侵襲能力的影響,流式細胞儀檢測mi R-203和BMI1對NSCLC細胞凋亡的作用。三.在食管鱗癌中mi R-93通過靶向調(diào)控DAB2促進細胞增殖和侵襲1.運用生物信息學方法預測及驗證具有靶向調(diào)控DAB2的mirco RNAs通過生物信息學軟件Target Scan對直接調(diào)控DAB2的mirco RNAs進行預測。查找mi R-93的成熟體序列并合成mi R-93的模擬體mimics瞬時轉(zhuǎn)染EC109細胞,利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后DAB2蛋白表達變化。運用雙熒光素酶活性實驗檢測mi R-93是否與DAB2-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。2.mi R-93通過靶向調(diào)控DAB2影響ESCC細胞的生物學功能用實時熒光定量PCR(q PCR)的方法檢測臨床病人NSCLC組織和癌旁組織中DAB2 m RNA和mi R-93的相對表達量。用mi R-93 mimics和DAB2-si RNA分別轉(zhuǎn)染ESCC細胞,通過CCK-8和Ed U方法檢測上述基因?qū)SCC細胞增殖的影響。流式細胞儀檢測mi R-93和DAB2對ESCC細胞周期的影響。用Transwell試驗檢測mi R-93和DAB2對ESCC細胞侵襲能力的影響。四.在食管鱗癌中mi R-218通過靶向調(diào)控BMI1抑制細胞增殖和遷移1.運用生物信息學方法預測及驗證具有靶向調(diào)控BMI1的mirco RNAs通過生物信息學軟件Target Scan、Pic Tar和mir Base對直接調(diào)控BMI1的mirco RNAs進行預測。查找mi R-218的成熟體序列并合成mi R-218的模擬體mimics瞬時轉(zhuǎn)染EC109細胞,利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后BMI1蛋白表達變化。運用雙熒光素酶活性實驗檢測mi R-218是否與BMI1 3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。2.mi R-218通過靶向調(diào)控BMI1影響ESCC細胞的生物學功能用實時熒光定量PCR(q PCR)的方法檢測臨床病人ESCC組織和癌旁組織中mi R-218和BMI1m RNA的相對表達量。用正常食管上皮細胞(HEEC)作為對照,通過q PCR試驗檢測mi R-218和BMI1 m RNA在ESCC細胞中的表達情況。用mi R-218mimics和BMI1-si RNA分別轉(zhuǎn)染ESCC細胞,通過CCK-8和Ed U方法檢測上述基因?qū)SCC細胞增殖的影響。用Transwell試驗檢測mi R-218和BMI1對ESCC細胞遷移和侵襲能力的影響。流式細胞儀檢測mi R-218和BMI1對ESCC細胞凋亡的作用。合成過表達BMI1(不含3’UTR)質(zhì)粒,構建過表達BMI1的ESCC細胞株,轉(zhuǎn)染mi R-218mimics后,檢測BMI1蛋白表達量的變化及對細胞表型的影響。結果:一.在非小細胞肺癌中mi R-296-5p通過靶向調(diào)控PLK1抑制細胞增殖1.mi R-296-5p靶向結合PLK1-3’UTR區(qū)域調(diào)控PLK1的蛋白表達。用mi R-296-5p mimics轉(zhuǎn)染NSCLC細胞,Western blot顯示PLK1蛋白表達量較對照組明顯下降。運用生物信息學軟件預測mi R-296-5p與PLK1-3’UTR的結合位點。用雙熒光素酶活性實驗檢測結果發(fā)現(xiàn)mi R-296-5p與PLK1-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。2.mi R-296-5p通過靶向調(diào)控PLK1影響NSCLC細胞的生物學功能在NSCLC組織中,PLK1的m RNA表達水平較癌旁組織明顯升高(P0.01),而mi R-296-5p的表達水平較癌旁組織明顯下降(P0.01)。與HBE細胞株相比PLK1的蛋白表達量在NSCLC細胞株中明顯上升,而mi R-296-5p的表達量在NSCLC細胞株中均下降。用mi R-296-5p mimics和PLK1-si RNA瞬時轉(zhuǎn)染NSCLC細胞株,通過CCK-8和Ed U方法檢測細胞增殖,結果顯示過表達mi R-296-5p和下調(diào)PLK1表達均能抑制NSCLC細胞的增殖。二.在非小細胞肺癌中mi R-203通過靶向調(diào)控BMI1抑制細胞增殖和侵襲1.mi R-203靶向結合BMI1-3’UTR區(qū)域調(diào)控BMI1的蛋白表達。用mi R-203 mimics轉(zhuǎn)染NSCLC細胞,Western blot顯示BMI1蛋白表達量較對照組明顯下降。運用生物信息學軟件預測mi R-203與BMI1-3’UTR的結合位點。用雙熒光素酶活性實驗檢測結果發(fā)現(xiàn)mi R-203與BMI1-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。2.mi R-203通過靶向調(diào)控BMI1影響NSCLC細胞的生物學功能在NSCLC組織中BMI1m RNA表達水平較癌旁組織明顯上升(P0.01),而mi R-203的表達水平較癌旁組織明顯下降(P0.01)。與HBE細胞株相比BMI1的蛋白表達量在NSCLC細胞株中明顯上升。用mi R-203 mimics和BMI1-si RNA瞬時轉(zhuǎn)染NSCLC細胞株,CCK-8和Ed U方法檢測細胞增殖,結果顯示過表達mi R-203和下調(diào)BMI1表達均能抑制NSCLC細胞增殖。用mi R-203 mimics和BMI1-si RNA瞬時轉(zhuǎn)染NSCLC細胞株,流式細胞儀檢測顯示過表達mi R-203或下調(diào)BMI1的表達均能促進細胞凋亡。用mi R-203 mimics和BMI1-si RNA瞬時轉(zhuǎn)染NSCLC細胞株,侵襲實驗表明過表達mi R-203或下調(diào)BMI1表達均能抑制細胞侵襲能力。三.在食管鱗癌中mi R-93通過靶向調(diào)控DAB2促進細胞增殖和侵襲1.mi R-93靶向結合DAB2-3’UTR區(qū)域調(diào)控DAB2的蛋白表達。用mi R-93 mimics轉(zhuǎn)染ESCC細胞,Western blot顯示DAB2蛋白表達量較對照組明顯下降。運用生物信息學軟件預測mi R-93與DAB2-3’UTR的結合位點。用雙熒光素酶活性實驗檢測結果發(fā)現(xiàn)mi R-93與DAB2-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。2.mi R-93通過靶向調(diào)控DAB2影響ESCC細胞的生物學功能在ESCC組織中DAB2 m RNA表達水平較癌旁組織明顯下降(P0.01),而mi R-93的表達水平較癌旁組織明顯上升(P0.05)。用mi R-93 mimics和DAB2-si RNA瞬時轉(zhuǎn)染ESCC細胞株,CCK-8和Ed U方法檢測細胞增殖,結果顯示過表達mi R-93和下調(diào)DAB2表達均能促進ESCC細胞的增殖。用mi R-93 mimics和DAB2-si RNA瞬時轉(zhuǎn)染ESCC細胞株,流式細胞儀檢測顯示過表達mi R-93或下調(diào)DAB2的表達均能促進細胞周期。用mi R-93 mimics和DAB2-si RNA瞬時轉(zhuǎn)染ESCC細胞株,侵襲實驗表明過表達mi R-93或下調(diào)DAB2表達均能促進細胞侵襲能力。四.在食管鱗癌中mi R-218通過靶向調(diào)控BMI1抑制細胞增殖和遷移1.mi R-218靶向結合BMI1-3’UTR區(qū)域調(diào)控BMI1的蛋白表達用mi R-218 mimics轉(zhuǎn)染ESCC細胞,Western blot顯示BMI1蛋白表達量較對照組明顯下降。運用生物信息學軟件預測mi R-218與BMI1-3’UTR的結合位點。用雙熒光素酶活性實驗檢測結果發(fā)現(xiàn)mi R-218與BMI1-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合。2.mi R-218通過靶向調(diào)控BMI1影響ESCC細胞的生物學功能在ESCC組織中mi R-218表達水平較癌旁組織明顯下降(P0.01),而BMI1m RNA的表達水平較癌旁組織明顯上升(P0.01)。與HEEC細胞株相比mi R-218表達量在ESCC細胞株中明顯下降。用mi R-218mimics和BMI1-si RNA瞬時轉(zhuǎn)染ESCC細胞株,CCK-8和Ed U方法檢測結果顯示過表達mi R-218和下調(diào)BMI1表達均能抑制ESCC細胞的增殖;流式細胞儀檢測顯示過表達mi R-218或下調(diào)BMI1的表達均能促進細胞凋亡;侵襲實驗表明過表達mi R-218或下調(diào)BMI1的表達均能抑制細胞的侵襲能力。用mi R-218 mimics轉(zhuǎn)染過表達PLK1但不含3’UTR質(zhì)粒的ESCC細胞株,Western blot顯示mi R-218下調(diào)BMI1的蛋白表達,但這種下調(diào)結果可被轉(zhuǎn)染PLK1質(zhì)�；謴�。同時mi R-218誘導的抑制ESCC的細胞增殖、細胞劃痕和細胞侵襲的效果可被過表達PLK1的質(zhì)�；謴�。結論:1.mi R-296-5p通過靶向結合PLK1抑制NSCLC細胞的增殖。2.mi R-203通過靶向結合BMI1抑制NSCLC細胞增殖、侵襲和促進細胞凋亡。3.mi R-93通過靶向調(diào)節(jié)DAB2的蛋白表達促進ESCC細胞的增殖和侵襲并促進細胞周期。4.mi R-218通過靶向調(diào)節(jié)BMI1的蛋白表達抑制ESCC細胞增殖和侵襲能力,同時促進細胞的凋亡。
【關鍵詞】：mi RNAs 非小細胞肺癌 食管癌 PLK1 BMI1 DAB2
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1;R734.2
【目錄】：

• 中文提要4-10
• Abstract10-21
• 前言21-26
• 第一部分 在非小細胞肺癌中mi R2965p通過靶向調(diào)控PLK1抑制細胞增殖26-50
• 1. 材料26-31
• 1.1 細胞株及組織樣本26-27
• 1.2 儀器及試劑27-29
• 1.3 試劑配制方法29-31
• 2. 研究方法及步驟31-39
• 2.1 生物信息學方法31-32
• 2.2 細胞培養(yǎng)32-33
• 2.3 細胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄c DNA的合成33-34
• 2.4 實時定量PCR（q PCR）34-35
• 2.5 統(tǒng)計分析 Real-Time PCR 結果35-36
• 2.6 瞬時轉(zhuǎn)染細胞36
• 2.7 雙熒光素酶報告基因活性檢測36-37
• 2.8 重組質(zhì)粒的構建37
• 2.9 生物信息學軟件和數(shù)據(jù)庫37-38
• 2.10 CCK-8 法檢測細胞增殖38
• 2.11 Ed U法檢測細胞增殖38-39
• 3. 結果39-47
• 3.1 初次篩選39
• 3.2 對初次篩選的mi RNAs進行驗證39-40
• 3.3 mi RNAs與目的基因 3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合40-42
• 3.4 在NSCLC組織中mi R2965p通過靶向調(diào)控PLK1影響NSCLC細胞的生物學功能42-47
• 4．討論47-50
• 第二部分 在非小細胞肺癌中mi R-203通過靶向調(diào)控BMI1抑制細胞增殖和侵襲50-67
• 1. 材料51-52
• 1.1 細胞株及組織樣本51
• 1.2 儀器及試劑51-52
• 1.3 試劑配制方法52
• 2. 研究方法及步驟52-55
• 2.1 生物信息學方法52
• 2.2 逆轉(zhuǎn)錄c DNA的合成和實時定量PCR（q PCR）52-53
• 2.3 統(tǒng)計分析Real-Time PCR結果53
• 2.4 雙熒光素酶報告質(zhì)粒構建53
• 2.5 雙熒光素酶報告基因活性檢測53-54
• 2.6 Transwell試驗檢測細胞的侵襲能力54-55
• 2.7 流式細胞儀技術檢測細胞凋亡55
• 3. 結果55-65
• 3.1 初次篩選55-56
• 3.2 對初次篩選的mi RNAs進行驗證56-57
• 3.3 mi R-203通過和基因 3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合來抑制BMI1基因的表達。57-59
• 3.4 在NSCLC組織中，mi R-203通過靶向調(diào)控BMI1影響NSCLC細胞的生物學功能。59-65
• 4. 討論65-67
• 第三部分 在食管鱗癌中mi R-93通過靶向調(diào)控DAB2抑制細胞增殖和遷移67-86
• 1. 材料68-69
• 1.1 細胞株及組織樣本68
• 1.2 儀器及試劑68
• 1.3 試劑配制方法68-69
• 2. 研究方法及步驟69-73
• 2.1 生物信息學方法69
• 2.2 逆轉(zhuǎn)錄c DNA的合成和實時定量PCR（q PCR）69-70
• 2.3 統(tǒng)計分析Real-Time PCR結果70
• 2.4 雙熒光素酶報告質(zhì)粒的構建70-72
• 2.5 細胞周期檢測72-73
• 3. 結果73-83
• 3.1 初次篩選73
• 3.2 對初次篩選的mi RNAs進行驗證73-74
• 3.3 mi R-93通過和基因 3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合來抑制BMI1基因的表達。74-77
• 3.4 在ESCC組織中，mi R-93通過靶向調(diào)控DAB2影響ESCC細胞的生物學功能。77-83
• 4. 討論83-86
• 第四部分 在食管鱗癌中mi R-218通過靶向調(diào)控BMI1抑制細胞增殖和遷移86-109
• 1. 材料87-88
• 1.1 細胞株及組織樣本87
• 1.2 儀器及試劑87
• 1.3 試劑配制方法87-88
• 2. 研究方法及步驟88-93
• 2.1 生物信息學方法88
• 2.2 逆轉(zhuǎn)錄c DNA的合成和實時定量PCR(q PCR)88-89
• 2.3 統(tǒng)計分析Real-Time PCR結果89
• 2.4 雙熒光素酶報告質(zhì)粒的構建89-90
• 2.5 過表達BMI載體的構建90-91
• 2.6 雙熒光素酶報告基因活性檢測91-92
• 2.7 細胞劃痕實驗92-93
• 3. 結果93-108
• 3.1 初次篩選93
• 3.2 對初次篩選的mi RNAs進行驗證93-94
• 3.3 mi R-218通過和基因 3’UTR區(qū)域的種子序列直接結合來抑制BMI1基因的表達。94-97
• 3.4 在ESCC組織中，，mi R-218通過靶向調(diào)控BMI1影響ESCC細胞的生物學功能。97-108
• 4. 討論108-109
• 小結109-110
• 參考文獻110-121
• 綜述 micro RNA在NSCLC中的研究進展121-133
• 參考文獻128-133
• 英文縮略詞表133-134
• 攻讀學位期間本人出版或公開發(fā)表的論著、論文134-135
• 致謝135-137

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Kumar Anupam;Chatopadhyay Tusharkant;Siddhartha Datta Gupta;Ralhan Ranju;;Loss of disabled-2 expression is an early event in esophageal squamous tumorigenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2006年37期

本文編號：542564