本文關(guān)鍵詞：一組細(xì)胞因子總量檢測(cè)方法的探討及其肝癌血清檢測(cè)的初步應(yīng)用研究

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【摘要】：研究背景目前已報(bào)道的原發(fā)性肝癌(primary liver cancer,PLC,以下簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌)相關(guān)標(biāo)志物很多,細(xì)胞因子(cytokines,CKs)就是其中一大類(lèi)。細(xì)胞因子是由機(jī)體多種細(xì)胞分泌的小分子蛋白質(zhì),通常通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面的相應(yīng)受體發(fā)揮生物學(xué)作用。研究表明,肝癌細(xì)胞高表達(dá)眾多細(xì)胞因子,包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factors,bFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)、中期因子(midkine,MK)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(platelet-derived endothelial cell growth factor,PD-ECGF)等,其在肝癌患者血清中也明顯升高,并且可能與肝內(nèi)侵襲、轉(zhuǎn)移、血行播散和預(yù)后不良有關(guān),被認(rèn)為可作為潛在靶分子用于肝癌診斷及治療。其中bFGF、VEGF、HGF、MK和OPN同屬于肝素結(jié)合性細(xì)胞因子。已知一種腫瘤可分泌多種腫瘤標(biāo)志物,不同的腫瘤或同種腫瘤的不同組織類(lèi)型可有某種相同的腫瘤標(biāo)志物,而且在不同的腫瘤患者體內(nèi),腫瘤標(biāo)志物的質(zhì)和量變化也較大。顯然,單獨(dú)檢測(cè)一種腫瘤標(biāo)志物,可能會(huì)由于測(cè)定方法的靈敏度不夠而出現(xiàn)假陰性,聯(lián)合檢測(cè)多種可以互補(bǔ)的腫瘤標(biāo)志物則能夠提高檢出的陽(yáng)性率。多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)一般分為系列診斷實(shí)驗(yàn)(串聯(lián))和平行診斷實(shí)驗(yàn)(并聯(lián))。串聯(lián)時(shí)因多個(gè)指標(biāo)同時(shí)陽(yáng)性才支持診斷,因此在提高特異性的同時(shí),降低了敏感性;并聯(lián)時(shí)只需一個(gè)指標(biāo)陽(yáng)性即可支持診斷,因此在提高敏感性的同時(shí),降低了特異性。因此,多個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)(串聯(lián)或并聯(lián))不可能同時(shí)提升敏感性和特異性,也無(wú)法使用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,簡(jiǎn)稱(chēng)ROC曲線)分析。鑒于這些情況,我們考慮,如果把幾個(gè)合適的指標(biāo)(都可能具有診斷價(jià)值且含量相近)集合成一個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),由于減少了檢測(cè)指標(biāo)的數(shù)目,并提高了測(cè)定閾,可能不僅能夠大大方便工作與分析,而且能夠同時(shí)顯著改善檢測(cè)的敏感性和特異性。研究目的在課題組前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,建立可檢測(cè)一組靶細(xì)胞因子總量的電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法,并進(jìn)行詳細(xì)的方法學(xué)考察及初步的臨床應(yīng)用研究,以期發(fā)展出一種優(yōu)于聯(lián)合檢測(cè)的新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其工作原理甚至可以直接被移植到其他實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),形成一個(gè)新的檢測(cè)技術(shù)發(fā)展方向。采用建立的方法對(duì)肝癌、多種類(lèi)型腫瘤、肝硬化、其他良性肝病等不同疾病患者及健康志愿者血清樣本進(jìn)行檢測(cè),包括檢測(cè)部分患者術(shù)后第1天、第3天和第5天血清樣本,分析其變化情況,為后續(xù)進(jìn)一步臨床分析、評(píng)價(jià)其在肝癌診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值打下基礎(chǔ)。方法1、采用抗體-肝素雙夾心法檢測(cè)一組肝素結(jié)合性細(xì)胞因子群總量,探討其可行性。(1)采用酶聯(lián)免疫法(雙抗體夾心法)繪制5種肝素結(jié)合性細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)曲線,并檢測(cè)、分析患者血清中的相應(yīng)含量。(2)采用酶聯(lián)免疫法(肝素-抗體雙夾心法)繪制5種肝素結(jié)合性細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)曲線,并檢測(cè)、分析患者血清中的相應(yīng)含量。(3)采用石墨電極板載量的電化學(xué)發(fā)光免疫法(肝素-抗體雙夾心法)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品及血清中5種肝素結(jié)合性細(xì)胞因子總量。2、在肝素結(jié)合性細(xì)胞因子檢測(cè)基礎(chǔ)上引入pdgf、pd-ecgf兩種細(xì)胞因子,篩選、確定幾個(gè)合適的靶因子進(jìn)行組合,采用電化學(xué)發(fā)光免疫法(雙抗體夾心法)檢測(cè)大樣本量的組合靶因子總量,比較其與afp在肝癌診斷特異性和敏感性方面的差異,并檢測(cè)部分患者術(shù)后第1天,第3天和第5天的血清樣本,觀察其變化情況。結(jié)果1、標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表明,針對(duì)7種細(xì)胞因子(bfgf、vegf、hgf、mk、opn、pdgf、pd-ecgf)的抗體對(duì)以及細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品的工作性能良好(其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r均大于0.99)。2、7種細(xì)胞因子(bfgf、vegf、hgf、mk、opn、pdgf、pd-ecgf)的抗體對(duì)用于檢測(cè)肝癌、肝硬化、良性肝病、其他類(lèi)型腫瘤及健康者血清的工作性能良好,絕大多數(shù)樣本檢測(cè)值都能落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍內(nèi)。3、采用抗體-肝素雙夾心elisa法檢測(cè)單個(gè)肝素結(jié)合性細(xì)胞因子(bfgf、vegf、hgf、mk、opn)時(shí),結(jié)果普遍偏低。原因可能是肝素與細(xì)胞因子結(jié)合的特異性差于抗體與抗原結(jié)合,肝素結(jié)合位點(diǎn)有限等。4、采用抗體-肝素雙夾心elisa法檢測(cè)一組肝素結(jié)合性細(xì)胞因子(bfgf、vegf、hgf、mk)時(shí),當(dāng)肝素濃度為10μg/ml時(shí),混合檢測(cè)所得值與單個(gè)檢測(cè)之和相近;當(dāng)肝素濃度10μg/ml時(shí),標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照中od值升高不明顯,但血清樣本od值仍不斷升高,甚至部分樣本計(jì)算所得濃度超過(guò)雙抗體夾心法所得濃度,可能原因是肝素捕獲了某些未被洗滌的非目標(biāo)肝素結(jié)合分子而導(dǎo)致的非特異染色。5、采用電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)HGF、MK、PDGF等3種因子總量時(shí),3種因子組合總量或者單獨(dú)檢測(cè)每一因子后數(shù)值相加所得總量都呈現(xiàn)直線相關(guān),無(wú)論濃度與信號(hào)都能一一對(duì)應(yīng),說(shuō)明對(duì)應(yīng)96孔石墨電極板載量完全能夠滿(mǎn)足3種抗體混合包被,并且證實(shí)混合抗體檢測(cè)多因子總量的可行性。6、采用電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)部分臨床樣本的結(jié)果顯示,肝癌組與肝血管瘤或肝內(nèi)膽管結(jié)石等良性肝病組及正常人之間HGF、MK、PDGF等3種因子總量具有顯著差異(P0.05),但是肝癌組與其他類(lèi)型腫瘤組之間無(wú)顯著差異(P0.05)。7、對(duì)比分析97例良惡性肝病患者(72例肝癌患者和25例良性肝病患者)血清中HGF、MK、PDGF等3種因子總量與AFP在特異性和敏感性方面的差異結(jié)果顯示,血清中3種因子總量檢測(cè)有助于肝癌診斷(ROC曲線下面積分別為0.8)。8、分析97例良惡性肝病患者(72例肝癌患者和25例良性肝病患者)手術(shù)前后血清中HGF、MK、PDGF等3種因子總量結(jié)果顯示,術(shù)后第1天,第3天和第5天,肝癌患者血清3種因子總量持續(xù)下降,良性肝病患者術(shù)后血清中3種因子總量下降則不明顯。這為我們后續(xù)進(jìn)一步探討一組靶細(xì)胞因子總量為一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)在肝癌診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)中的應(yīng)用研究打下了基礎(chǔ)。結(jié)論建立的電化學(xué)發(fā)光免疫法用于檢測(cè)HGF、MK、PDGF等3種細(xì)胞因子總量簡(jiǎn)單實(shí)用,有用于肝癌輔助診斷、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷的潛能。3種靶分子在多種類(lèi)型腫瘤患者血清中也有升高,可能兼具多種類(lèi)型腫瘤的臨床應(yīng)用潛能,有待進(jìn)一步進(jìn)行雙盲驗(yàn)證、規(guī)�；�(yàn)證以及術(shù)后長(zhǎng)期隨訪對(duì)比分析。由于3種目標(biāo)分子沒(méi)有統(tǒng)一的參考物質(zhì)和參考檢測(cè)方法,以及各生產(chǎn)商使用的標(biāo)準(zhǔn)品及抗體組成存在差異,檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化是一技術(shù)挑戰(zhàn),可能會(huì)限制臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的進(jìn)程。
【關(guān)鍵詞】：肝癌 細(xì)胞因子 診斷 預(yù)后
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 序言12-16
• 第一部分 基于肝素捕獲的肝素結(jié)合性細(xì)胞因子群總量檢測(cè)的可行性研究16-34
• 一、材料與方法16-21
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-30
• 三、討論30-34
• 第二部分 基于抗體捕獲的一組細(xì)胞因子總量檢測(cè)的可行性和初步臨床應(yīng)用研究34-50
• 一、材料與方法34-36
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-46
• 三、討論46-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 文獻(xiàn)綜述一56-65
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 文獻(xiàn)綜述二65-73
• 參考文獻(xiàn)70-73
• 中英文縮略詞表73-75
• 在讀期間參加科研工作和發(fā)表論文情況75-76
• 致謝76-78

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本文編號(hào)：521695