本文關(guān)鍵詞：ONYX-015與Nutlin-3a對(duì)惡性間皮瘤細(xì)胞的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:惡性間皮瘤(Malignant mesothelioma),通常也稱(chēng)為彌漫性惡性間皮瘤。現(xiàn)今,惡心間皮瘤的發(fā)病原因及機(jī)制仍不十分清楚,但幾乎與所有種類(lèi)的石棉類(lèi)物質(zhì)的過(guò)多暴露呈直接相關(guān)。隨著1970年以來(lái),尤其是工業(yè)化國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家,石棉類(lèi)物質(zhì)的生產(chǎn)消費(fèi)增加,惡性間皮瘤患者不斷增加。這種疾病潛伏期可以長(zhǎng)度超過(guò)30年。預(yù)計(jì)未來(lái)的幾十年中,惡性間皮瘤的患者數(shù)量仍將持續(xù)增長(zhǎng)�？墒侨缃�,還沒(méi)有非常行之有效的預(yù)防措施。當(dāng)下對(duì)于腫瘤的治療方式繁多,但是惡性間皮瘤仍然是難以治療的。惡性間皮瘤中胸膜間皮瘤約占75%,惡性腹膜間皮瘤排名緊隨其后。惡性間皮瘤的早期典型臨床癥狀和體征缺乏特異性,極易誤診、漏診,檢出率低。惡性間皮瘤快速的在胸膜腔或者腹膜腔生長(zhǎng)、浸潤(rùn),手術(shù)治療只適合早期病患,即使進(jìn)行胸膜切除根治術(shù)后,復(fù)發(fā)率也非常高。惡性間皮瘤對(duì)于放射性治療并不敏感,所以只在部分姑息治療的病例中使用。因此,化學(xué)療法受到廣泛的認(rèn)同,全身化療是現(xiàn)行主要的治療方法,順鉑(CDDP)和培美曲塞(PEM)是當(dāng)前一線化療方案,但是治療后中位生存期不足一年。所以,迫切需要一個(gè)新的基于惡性間皮瘤的分子機(jī)制的治療策略,對(duì)于延長(zhǎng)患者生存期和提高生活質(zhì)量是十分必要的。惡性間皮瘤大多含有存在野生型p53基因,但是p53蛋白表達(dá)功能受到限制,不能誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡通路。主要是因?yàn)閜16基因INK4A位點(diǎn),以及p14基因ARF位點(diǎn)存在基因缺陷,由此無(wú)法完成p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。ONYX-015是一種選擇性增殖腺病毒,具有優(yōu)越的選擇特異性能力,在正常細(xì)胞中低量增殖甚至不增殖,而在腫瘤細(xì)胞中大量增殖。同時(shí),ONYX-015還可以完善腫瘤細(xì)胞內(nèi)的p53通路,激活p53信號(hào)通路,從而表達(dá)p53蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Nutlin-3a是高度特異性的MDM2(murine double minute2)蛋白小分子抑制劑,可以通過(guò)與MDM2結(jié)合,抑制MDM2蛋白功能,打斷MDM2-p53環(huán),通過(guò)抑制蛋白酶體功能減少p53降解。80%以上的p53蛋白的降解通過(guò)蛋白酶體,當(dāng)?shù)鞍酌阁w受到抑制,p53蛋白通過(guò)堆積使細(xì)胞進(jìn)入凋亡。本研究通過(guò)ONYX-015與Nutlin-3a在間質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用效果,ONYX-015表達(dá)p53基因,Nutlin-3a減少p53降解,檢測(cè)ONYX-015和Nutlin-3a的抗腫瘤效果,抑制細(xì)胞生長(zhǎng)能力。結(jié)果顯示,ONYX-015提高p53表達(dá)水平,促進(jìn)p53磷酸化,同時(shí),Nutlin-3a特異性的與惡性間皮瘤中MDM2蛋白的結(jié)合,蛋白酶體功能受到抑制,p53降解減少,導(dǎo)致p53蛋白堆積,同時(shí)p21表達(dá)升高并且磷酸化Rb的表達(dá)降低,細(xì)胞凋亡蛋白酶3(cleaved caspase-3)和細(xì)胞凋亡蛋白酶8(cleaved caspase-8)表達(dá)升高,激活p53介導(dǎo)的外源性凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路。方法:本實(shí)驗(yàn)使用體外培養(yǎng)惡性間皮瘤:MSTO-211H,NCI-H28,EHMES-10,NCI-H2052,EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B細(xì)胞株。以MTT實(shí)驗(yàn),通過(guò)MTT結(jié)果計(jì)算50%抑制藥物濃度值(IC50),判斷對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞對(duì)選擇性腺病毒(選用ONYX-015)及MDM2蛋白抑制劑(選用Nutlin-3a)在以上惡性間皮瘤細(xì)胞系的抑制敏感性。并使用Trypan blue dye exclusion assay檢測(cè)ONYX-015對(duì)以上惡性間皮瘤細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期,分析ONYX-015對(duì)Sub-G1期為主的細(xì)胞周期的影響。使用Western blot方法分析ONYX-015及Nutlin-3a使用所導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的傳導(dǎo)通路變化。最后,運(yùn)用細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè),ONYX-015和Nutlin-3a聯(lián)合用藥相比于單獨(dú)用藥的藥效區(qū)別,將產(chǎn)生協(xié)同作用還是拮抗作用。β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)基因腺病毒(Ad/Lac Z)作為細(xì)胞毒性低的腺病毒,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中作為陰性對(duì)照。結(jié)果:1 MTT的分析結(jié)果人體惡性間皮瘤細(xì)胞系:MSTO-211H,NCI-H28,EHMES-10,NCI-H2052,EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B經(jīng)過(guò)不同濃度的ONYX-015和處理對(duì)細(xì)胞活性的影響,Ad-Lac Z作為陰性對(duì)照。CI50結(jié)果顯示MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052、EHMES-10細(xì)胞較為敏感。同時(shí)結(jié)果提示MSTO-211H細(xì)胞對(duì)ONYX-015最為敏感,其次是NCI-H28、EHMES-10細(xì)胞對(duì)ONYX-015較為敏感。之后是NCI-H2052細(xì)胞,而EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B細(xì)胞對(duì)ONYX-015不敏感。原因?yàn)镋HMES-1,NCI-2452及JMN-1B為變異性p53細(xì)胞株,MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052、EHMES-10為野生型p53細(xì)胞株。說(shuō)明變異型p53細(xì)胞系普遍對(duì)ONYX-015不敏感。野生型p53細(xì)胞MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052、EHMES-10經(jīng)過(guò)Nutlin-3a處理,MSTO-211H、NCI-H28、EHMES-10細(xì)胞較為敏感,Nutlin-3a抑制了MSTO-211H、NCI-H28細(xì)胞的惡性間皮瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。根據(jù)MTT計(jì)算的IC50結(jié)果提示NCI-H28細(xì)胞對(duì)Nutlin-3a最為敏感,其次是MSTO-211H細(xì)胞,之后是EHMES-10細(xì)胞,NCI-H2052細(xì)胞對(duì)Nutlin-3a敏感性不佳。2臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)(Trypan blue dye exclusion assay)Trypan blue dye exclusion assay結(jié)果顯示:ONYX-015抑制了MSTO-211H、NCI-H28細(xì)胞的惡性間皮瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。而Ad/Lac Z對(duì)照組生長(zhǎng)情況與空白對(duì)照組類(lèi)似,未受到明顯抑制。3流式細(xì)胞周期的分析結(jié)果分別使用ONYX-015和Ad/Lac Z感染惡性間皮瘤細(xì)胞NCI-H28和MSTO-211H,Ad/Lac Z作為陰性對(duì)照。ONYX-015導(dǎo)致NCI-H28細(xì)胞周期sub-G1期明顯比例提升,以及細(xì)胞周期G2/M期比例提升,S期和G0/G1期比例減低。MSTO-211H細(xì)胞表現(xiàn)為Sub-G1比例,以及G0/G1期比例提升,G2/M期與S期比例變化幅度不明顯。兩種細(xì)胞對(duì)比,NCI-H28細(xì)胞與MSTO-211H細(xì)胞Sub-G1的比例相比,NCI-H28細(xì)胞的Sub-G1增加的更加明顯,說(shuō)明NCI-H28細(xì)胞對(duì)ONYX-015更加敏感性。同時(shí),陰性對(duì)照Ad/Lac Z組的結(jié)果與空白對(duì)照組不存在明顯差異。4蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)的分析結(jié)果4.1使用Western blot分析檢測(cè)ONYX-015在MSTO-211H和NCI-H28細(xì)胞介導(dǎo)p53的分子信號(hào)通路。p53蛋白及下游產(chǎn)物升高,磷酸化Rb降低。4.2在MSTO-211H和NIC-H28兩個(gè)細(xì)胞中,ONYX-015處理后沒(méi)有誘導(dǎo)caspase-9的剪切,但誘發(fā)了caspase-3和caspase-8的剪切。以上結(jié)果表明p53介導(dǎo)的外源性凋亡通路的信號(hào)傳導(dǎo)通路被ONYX-015激活。5 MTT分析ONYX-015與Nutlin-3a的聯(lián)合作用對(duì)人體惡性間皮瘤NCI-H28和MSTO-211H細(xì)胞進(jìn)行不同濃度的ONYX-015與Nutlin-3a作用后,選擇適當(dāng)?shù)穆?lián)合藥物濃度進(jìn)行試驗(yàn),再進(jìn)行英國(guó)劍橋開(kāi)發(fā)的Calcu Syn軟件分析后聯(lián)合用藥指數(shù)CI顯示:ONYX-015與Nutlin-3a聯(lián)合藥物應(yīng)用對(duì)惡性間皮瘤細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同的抑制作用。結(jié)論:1 ONYX-015有效抑制了野生型p53的惡性間皮瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。2 ONYX-015導(dǎo)致惡性間皮瘤細(xì)胞凋亡。3 ONYX-015使p53介導(dǎo)的外源性分子信號(hào)傳導(dǎo)通路完成表達(dá),提高p53及下游產(chǎn)物表達(dá)水平。4 Nutlin-3a有效抑制了惡性間皮瘤細(xì)胞的增殖,介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。5 ONYX-015和Nutlin-3a聯(lián)合藥物應(yīng)用對(duì)惡性間皮瘤細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同的抑制效果。
【關(guān)鍵詞】：惡性間皮瘤 ONYX-015 MDM2蛋白抑制劑 Nutlin-3a 化學(xué)治療
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R73-36
【目錄】：

• 摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫(xiě)13-15
• 前言15-18
• 材料與方法18-22
• 結(jié)果22-24
• 附圖24-31
• 討論31-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-43
• 綜述 惡性間皮瘤的治療前景43-53
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 致謝53-54
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷54

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 劉都戶(hù);劉文超;范黎;盛蓉;薛妍;王微;王錦;黃穎;;今又生聯(lián)合熱療治療漿膜腔惡性積液近期療效[J];中華腫瘤防治雜志;2006年14期

2 鄔黎青;詹媛;王莉;陳玲;陳小青;楊洋;高歌;郝華;;Nutlin-3a誘導(dǎo)p73α對(duì)p53突變型結(jié)腸癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究[J];中國(guó)全科醫(yī)學(xué);2014年36期

  本文關(guān)鍵詞：ONYX-015與Nutlin-3a對(duì)惡性間皮瘤細(xì)胞的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：508365