本文關鍵詞：雙重測序法結合芯片捕獲檢測低頻突變的方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：液體活檢,即通過血液或者體液檢測腫瘤循環(huán)DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),獲得腫瘤基因突變的信息,具有非侵入性、取樣方便、可持續(xù)監(jiān)測的特點,是腫瘤個體化治療的重要工具。由于ctDNA具有的含量一般低于1%,并且腫瘤呈現(xiàn)高度異質(zhì)性,而新一代測序技術存在約1%的錯誤率,使突變信息難以被準確檢測到。雙重測序法利用文庫片段兩端的隨機標簽組合去除測序錯誤,可以將測序準確度提高10000倍以上。因此本文利用6個已知突變頻率的尿液來驗證雙重測序法結合芯片捕獲技術的靈敏度,并用1例膀胱癌手術前后的尿液樣本來證明該方法在腫瘤液體活檢的可行性。本文探討研究了雙重測序法結合芯片捕獲技術的靈敏度,以及方法在真實樣本檢測中的可行性。方法的靈敏度:在正常人尿液提取的DNA中加入1%,0.1%,0.01%的胃癌823細胞系DNA(擁有90個已知的突變位點)作為模擬樣本,通過雙重測序法和包含胃癌細胞系DNA 90個突變的芯片來建庫捕獲,檢測混合樣品里的突變位點。檢測膀胱癌突變的可行性:用雙重測序法結合芯片捕獲技術對1例膀胱癌患者術前和術后的尿液DNA,一個正常人的尿液DNA進行檢測,比較3個樣品的基因突變情況。靈敏度測試的結果顯示,在3個梯度的突變率中均能檢測出突變,測序深度達到8000x時,含1%突變的樣本的真實突變檢出率大于66%,準確率大于93%。該方法用于檢測膀胱癌突變時,芯片捕獲率約60%,在病人術前、術后和正常人的尿液DNA中分別找到了39個,1個和4個突變位點。本研究說明,雙重測序法是一個能夠檢測到0.01%低頻突變的方法,結合芯片捕獲技術,可特異性地檢測膀胱癌尿液樣本中疾病相關的基因突變位點。雙重測序結合芯片捕獲技術檢測低頻突變,是一個有發(fā)展?jié)摿Σ⑶冶容^新的方法,需要更多的樣本和數(shù)據(jù)支持,讓它可以更好更廣泛地應有。
【關鍵詞】：腫瘤循環(huán)DNA 低頻突變 雙重測序 芯片捕獲
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R73-3
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 第一章 緒論9-27
• 1.1 前言9
• 1.2 腫瘤與基因突變的概述9-13
• 1.2.1 腫瘤基因突變檢測的進展10-12
• 1.2.2 腫瘤個性化治療的發(fā)展12-13
• 1.3 無創(chuàng)腫瘤基因檢測技術的發(fā)展13-16
• 1.3.1 血液ctDNA無創(chuàng)檢測技術13-15
• 1.3.2 糞便和尿液無創(chuàng)檢測技術15-16
• 1.4 低頻檢測技術的發(fā)展16-18
• 1.4.1 COLD-PCR技術16-17
• 1.4.2 Digital PCR技術17
• 1.4.3 高分辨率熔解曲線分析技術17-18
• 1.5 本課題研究背景和研究內(nèi)容18-27
• 1.5.1 研究背景18
• 1.5.2 研究內(nèi)容18-25
• 1.5.3 研究方案25-27
• 第二章 靈敏度測試27-43
• 2.1 實驗材料27-29
• 2.1.1 樣品27
• 2.1.2 主要儀器設備27-28
• 2.1.3 主要試劑28
• 2.1.4 主要耗材28-29
• 2.2 實驗方法29-36
• 2.2.1 提取尿液基因組DNA29-30
• 2.2.2 樣品檢測30
• 2.2.3 芯片設計30
• 2.2.4 文庫構建30-34
• 2.2.5 測序34
• 2.2.6 下機數(shù)據(jù)處理34-36
• 2.3 實驗結果36-40
• 2.4 討論40-43
• 第三章 臨床可行性測試43-57
• 3.1 實驗材料43
• 3.1.1 樣品43
• 3.1.2 主要儀器設備43
• 3.1.3 主要試劑43
• 3.1.4 主要耗材43
• 3.2 實驗方法43-46
• 3.2.1 接頭退火方法的比較43-45
• 3.2.2 臨床樣品的檢測應用45-46
• 3.3 實驗結果46-52
• 3.3.1 不同接頭退火方法的比較46-50
• 3.3.2 臨床樣品的檢測應用50-52
• 3.4 討論52-57
• 結論57-58
• 參考文獻58-63
• 附錄63-67
• 致謝67-68
• 附件68

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  本文關鍵詞：雙重測序法結合芯片捕獲檢測低頻突變的方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：485321