發(fā)布時(shí)間：2017-06-08 00:02

  本文關(guān)鍵詞：UC-MSCs條件培養(yǎng)基對(duì)HepG2影響的miRNAs差異表達(dá)譜分析及miR-3065-5p功能的初步探討，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一類多潛能成體干細(xì)胞,廣泛存在于動(dòng)物胎兒和成體多種組織器官中,例如：脂肪、軟骨、骨髓、羊水、臍帶和胎盤等。MSCs可以向腫瘤歸巢,參與腫瘤基質(zhì)形成,通過分泌一些細(xì)胞因子影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和腫瘤血管的形成,并且能夠改變腫瘤內(nèi)源性miRNAs的表達(dá)水平,進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),一定濃度的UC-MSCs條件培養(yǎng)基能夠抑制肝癌HepG2的增殖。為深入了解其分子機(jī)制,我們首先對(duì)UC-MSCs條件培養(yǎng)基處理HepG2不同時(shí)間(1h、6h、12h、24h)后的4個(gè)處理組和對(duì)照組HepG2(Oh)樣本進(jìn)行Small RNAs高通量測(cè)序,構(gòu)建了miRNAs差異表達(dá)譜。結(jié)果顯示：從對(duì)照組到處理組的5組cDNA文庫(kù)中,分別獲得1091、1079、1164、1086和1193萬余條干凈序列；與基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn),每組樣本均達(dá)到67%以上的基因組覆蓋率；進(jìn)一步與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn),5組樣本分別檢測(cè)出942,995,1031,976和958種miRNAs成熟體。另外,處理組與對(duì)照組比對(duì)差異表達(dá)miRNAs數(shù)目表明,隨著條件培養(yǎng)基處理時(shí)間的延伸,差異表達(dá)的miRNAs數(shù)目逐步增多,miRNAs的表達(dá)始終處于持續(xù)變化的狀態(tài)。此外,為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的可靠性,用qRT-PCR方法對(duì)10個(gè)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示,miRNAs的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果基本一致。其次,采用TargetScan軟件預(yù)測(cè)了差異表達(dá)miRNAs的可能靶基因,并對(duì)這些靶基因進(jìn)行GO功能和KEGG信號(hào)通路注釋。結(jié)果顯示：這些差異表達(dá)miRNAs的候選靶基因主要集中在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)功能中；這些候選靶基因顯著富集于多條信號(hào)通路中,例如：MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、單純皰疹感染和氨基糖代謝等通路；這提示UC-MSCs條件培養(yǎng)基確實(shí)會(huì)影響HepG2細(xì)胞的生理生化相關(guān)信號(hào)通路。再次,為更好地闡明UC-MSCs條件培養(yǎng)基抑制HepG2增殖的分子機(jī)理,我們將HepG2細(xì)胞的Small RNAs數(shù)據(jù)與前期實(shí)驗(yàn)室分析該樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：上調(diào)miRNAs與下調(diào)mRNAs之間的互作調(diào)控模式有12條；下調(diào)miRNAs與上調(diào)mRNAs之間的互作調(diào)控模式有5條。例如：輸出數(shù)據(jù)中,差異倍數(shù)較大的miR-375負(fù)調(diào)控基因ARHGAP21和JUND的表達(dá),表達(dá)豐度較高的let-7f-3p和miR-34a-3p協(xié)同抑制因子IL6的表達(dá)。最后,篩選出增殖條目下的差異表達(dá)miR-3065-5p進(jìn)行功能驗(yàn)證,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),過表達(dá)miR-3065-5p可以顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖和侵襲,說明miR-3065-5p是一個(gè)潛在的腫瘤抑制miRNA。此外,miR-3065-5p過表達(dá)可降低HepG2細(xì)胞中的SATB1的表達(dá),可推測(cè)SATB1極有可能是miR-3065-5p的靶基因。
【關(guān)鍵詞】：UC-MSCs條件培養(yǎng)基 HepG2 miRNAs表達(dá)譜 功能驗(yàn)證
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 符號(hào)說明10-11
• 第一章 miRNAs在肝癌發(fā)病中的作用(文獻(xiàn)綜述)11-16
• 1.1 miRNAs的概述11-12
• 1.2 miRNAs在肝癌發(fā)病中的作用12-15
• 1.2.1 miRNAs在肝癌發(fā)病中的基礎(chǔ)研究12-14
• 1.2.2 miRNAs在肝癌發(fā)病中的臨床研究14-15
• 1.3 結(jié)論與展望15-16
• 第二章 HepG2細(xì)胞系Small RNAs高通量測(cè)序及全局分析16-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 2.1.1 細(xì)胞材料16
• 2.1.2 主要試劑與藥品16-17
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-23
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)基配制17
• 2.2.2 HepG2和UC-MSCs培養(yǎng)17-19
• 2.2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇17-18
• 2.2.2.2 細(xì)胞傳代并鋪板18
• 2.2.2.3 UC-MSCs條件培養(yǎng)基處理HepG2細(xì)胞18
• 2.2.2.4 總RNA提取18-19
• 2.2.2.5 RNA純化19
• 2.2.3 HepG2細(xì)胞系RNA樣本的質(zhì)量檢測(cè)19
• 2.2.4 HepG2細(xì)胞系cDNA文庫(kù)制備及高通量測(cè)序19-20
• 2.2.5 HepG2細(xì)胞系Small RNAs測(cè)序數(shù)據(jù)輸出及全局分析20-23
• 2.2.5.1 Small RNAs測(cè)序數(shù)據(jù)的輸出20
• 2.2.5.2 已知miRNAs鑒定20-21
• 2.2.5.3 miRNAs差異表達(dá)分析21
• 2.2.5.4 qRT-PCR驗(yàn)證21-22
• 2.2.5.5 miRNAs候選靶基因GO功能注釋分析22
• 2.2.5.6 miRNAs候選靶基因KEGG信號(hào)通路注釋分析22-23
• 2.2.5.7 肝癌HepG2細(xì)胞系miRNAs與mRNAs數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析23
• 2.3 結(jié)果與分析23-35
• 2.3.1 HepG2細(xì)胞系RNA樣本質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果23-24
• 2.3.2 HepG2細(xì)胞系Small RNAs高通量測(cè)序及全局分析24-35
• 2.3.2.1 Small RNAs測(cè)序數(shù)據(jù)的輸出統(tǒng)計(jì)24
• 2.3.2.2 已知miRNAs鑒定結(jié)果24-25
• 2.3.2.3 miRNAs差異表達(dá)分析結(jié)果25-27
• 2.3.2.4 qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果27-28
• 2.3.2.5 miRNAs候選靶基因GO功能注釋分析結(jié)果28-30
• 2.3.2.6 miRNAs候選靶基因KEGG信號(hào)通路注釋分析結(jié)果30-34
• 2.3.2.7 差異表達(dá)miRNAs與mRNAs關(guān)聯(lián)分析結(jié)果34-35
• 2.4 討論35-37
• 2.5 結(jié)論37-38
• 第三章 miR-3065-5p對(duì)HepG2的生物學(xué)行為的影響38-47
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料38
• 3.1.1 主要試劑與耗材38
• 3.1.2 主要儀器設(shè)備38
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染39
• 3.2.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)39
• 3.2.3 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)39-40
• 3.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè)40
• 3.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)40
• 3.2.6 靶基因表達(dá)水平檢測(cè)40
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-45
• 3.3.1 miRNA agomir轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證40-41
• 3.3.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)結(jié)果41-42
• 3.3.3 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)結(jié)果42-43
• 3.3.4 細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果43
• 3.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果43-44
• 3.3.6 靶基因表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果44-45
• 3.4 討論45-46
• 3.5 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-56
• 附錄56-63
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果63-64
• 致謝64

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本文編號(hào)：430683