發(fā)布時間：2024-05-18 12:16

　　背景:乳腺癌是一種威脅全球女性生命健康的惡性腫瘤,而惡性腫瘤的標(biāo)志之一是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移,腫瘤患者90%以上的致死率都是由轉(zhuǎn)移引起的。乳腺癌是一種由腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等組成的高度復(fù)雜的微環(huán)境系統(tǒng),腫瘤細(xì)胞能產(chǎn)生高水平的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),作用于基質(zhì)成纖維細(xì)胞使其產(chǎn)生氧化應(yīng)激進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性;間質(zhì)細(xì)胞能夠通過分泌一些生長因子來調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用。成纖維細(xì)胞能夠在腫瘤微環(huán)境中被激活并轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(Cancer-Associated Fibroblasts,CAFs),CAFs是腫瘤間質(zhì)中最豐富的細(xì)胞成分,能夠通過啟動腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,但是其具體機制尚不明確。EMT被認(rèn)為是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟,轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)信號通路是腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的經(jīng)典通路,TGF-β1還是潛在的自噬激活劑,能夠促進(jìn)纖維化的產(chǎn)生。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1能誘導(dǎo)血...

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 乳腺癌微環(huán)境
        1.1.1 局部微環(huán)境
        1.1.2 轉(zhuǎn)移性微環(huán)境
        1.1.3 氧化應(yīng)激改變?nèi)橄侔┪h(huán)境
    1.2 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)
        1.2.1 CAFs的起源和特性
        1.2.2 乳腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用
        1.2.3 CAFs通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移
    1.3 TGF-β
        1.3.1 TGF-β1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用
        1.3.2 TGF-β1與自噬
            1.3.2.1 自噬和自噬對腫瘤的影響
            1.3.2.2 TGF-β1通過自噬影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展
        1.3.3 TGF-β1與CAFs
    1.4 立題依據(jù)
第2章 成纖維細(xì)胞NIH3T3氧化應(yīng)激細(xì)胞模型模擬腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)胞株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器與設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 主要工作液的配制
        2.2.2 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代和凍存
        2.2.3 MTS細(xì)胞毒性實驗測定成纖維細(xì)胞NIH3T3的存活率
        2.2.4 酶標(biāo)儀測定成纖維細(xì)胞NIH3T3 MDA(丙二醛)含量
        2.2.5 成纖維細(xì)胞NIH3T3 SOD(超氧化物歧化酶)活力測定
        2.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測成纖維細(xì)胞NIH3T3活性氧ROS
        2.2.7 數(shù)據(jù)處理及分析
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 H₂O₂對成纖維細(xì)胞NIH3T3存活率的影響
        2.3.2 H₂O₂對成纖維細(xì)胞NIH3T3 MDA含量及SOD活力的影響
        2.3.3 H₂O₂對成纖維細(xì)胞NIH3T3活性氧ROS水平的影響
    2.4 小結(jié)與討論
第3章 TGF-β1緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)下成纖維細(xì)胞NIH3T3的損傷并促進(jìn)其向CAFs的轉(zhuǎn)化
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞株
        3.1.2 主要試劑與材料
        3.1.3 主要儀器與設(shè)備
    3.2 方法
        3.2.1 主要工作液的配制
        3.2.2 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代、凍存
        3.2.3 MTS細(xì)胞毒性實驗測定成纖維細(xì)胞NIH3T3存活率
        3.2.4 MDA含量測定
        3.2.5 SOD活力測定
        3.2.6 流式細(xì)胞術(shù)測定成纖維細(xì)胞NIH3T3活性氧ROS
        3.2.7 RT-qPCR檢測CAFs標(biāo)志物α-SMA/FAP-α/Cav-1 mRNA表達(dá)水平
        3.2.8 Western blotting法檢測CAFs標(biāo)志物α-SMA/FAP-α/Cav-1的蛋白表達(dá)水平
        3.2.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 TGF-β1對氧化應(yīng)激狀態(tài)下成纖維細(xì)胞NIH3T3增殖的影響
        3.3.2 TGF-β1對氧化應(yīng)激狀態(tài)下成纖維細(xì)胞NIH3T3 MDA含量與SOD活力的影響
        3.3.3 TGF-β1對氧化應(yīng)激狀態(tài)下成纖維細(xì)胞NIH3T3活性氧ROS水平的影響
        3.3.4 TGF-β1對氧化應(yīng)激狀態(tài)下成纖維細(xì)胞NIH3T3 α-SMA/ FAP-α/Cav-1 mRNA表達(dá)的影響
        3.3.5 TGF-β1對氧化應(yīng)激狀態(tài)下成纖維細(xì)胞NIH3T3 α-SMA/ FAP-α/Cav-1 蛋白表達(dá)的影響
    3.4 小結(jié)與討論
第4章 TGF-β1通過自噬誘導(dǎo)氧化應(yīng)激條件下成纖維細(xì)胞NIH3T3向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)的轉(zhuǎn)化
    4.1 材料
        4.1.1 細(xì)胞株
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器與設(shè)備
    4.2 方法
        4.2.1 主要溶液的配制
        4.2.2 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代、凍存
        4.2.3 RT-qPCR檢測自噬標(biāo)志物Beclin1及LC3β mRNA表達(dá)水平
        4.2.4 Western blotting法檢測自噬標(biāo)志物Beclin1及LC3β的蛋白表達(dá)水平
        4.2.5 透射電鏡觀察成纖維細(xì)胞NIH3T3的自噬結(jié)構(gòu)
        4.2.6 激光共聚焦檢測CAFs標(biāo)志物FAP-α與自噬標(biāo)志物L(fēng)C3β共定位
        4.2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 TGF-β1對氧化應(yīng)激狀態(tài)下成纖維細(xì)胞NIH3T3 Beclin1及LC3βmRNA表達(dá)的影響
        4.3.2. TGF-β1對氧化應(yīng)激狀態(tài)下成纖維細(xì)胞NIH3T3 Beclin1及LC3β蛋白表達(dá)的影響
        4.3.3 TGF-β1增加了氧化應(yīng)激狀態(tài)下成纖維細(xì)胞NIH3T3自噬小體的產(chǎn)生
        4.3.4 TGF-β1增強了氧化應(yīng)激狀態(tài)下成纖維細(xì)胞NIH3T3 FAP-α與LC3β的共定位
    4.4 小結(jié)與討論
第5章 成纖維細(xì)胞NIH3T3與小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1共培養(yǎng)模型模擬腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建
    5.1 材料
        5.1.1 細(xì)胞株
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要儀器與設(shè)備
    5.2 方法
        5.2.1 主要溶液的配制
        5.2.2 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代、凍存
        5.2.3 細(xì)胞劃痕實驗考察細(xì)胞遷移能力
        5.2.4 細(xì)胞遷移實驗檢測腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)
        5.2.5 細(xì)胞侵襲實驗檢測腫瘤細(xì)胞的侵襲數(shù)
        5.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)促進(jìn)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1的遷移
        5.3.2 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)促進(jìn)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1的侵襲轉(zhuǎn)移
    5.4 小結(jié)與討論
第6章 TGF-β1通過誘導(dǎo)CAFs形成啟動EMT從而促進(jìn)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1的侵襲轉(zhuǎn)移
    6.1 材料
        6.1.1 細(xì)胞株
        6.1.2 主要試劑與材料
        6.1.3 主要儀器與設(shè)備
    6.2 方法
        6.2.1 主要溶液的配制
        6.2.2 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代、凍存
        6.2.3 Western Blotting檢測EMT標(biāo)志物E-Cadherin及N-Cadherin蛋白表達(dá)
        6.2.4 siRNA特異性干擾FAP-α的表達(dá)
        6.2.5 RT-qPCR和Western Blotting法檢測FAP-α干擾效果
        6.2.6 細(xì)胞遷移實驗檢測腫瘤細(xì)胞的遷移數(shù)
        6.2.7 細(xì)胞侵襲實驗檢測腫瘤細(xì)胞的侵襲數(shù)
        6.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 CAFs對4T1細(xì)胞E-Cadherin和N-Cadherin蛋白表達(dá)的影響
        6.3.2 siRNA FAP-α后顯著降低FAP-α mRNA和蛋白的表達(dá)水平
        6.3.3 siRNA FAP-α后,細(xì)胞共培養(yǎng)后CAFs對4T1細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響
        6.3.4 siRNA FAP-α后,細(xì)胞共培養(yǎng)后4T1細(xì)胞發(fā)生EMT逆轉(zhuǎn)
    6.4 小結(jié)與討論
第7章 小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1與成纖維細(xì)胞NIH3T3混合接種移植瘤模型的建立
    7.1 材料
        7.1.1 細(xì)胞株及動物
        7.1.2 主要試劑
        7.1.3 主要儀器與設(shè)備
    7.2 方法
        7.2.1 主要溶液的配制
        7.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存
        7.2.3 檢測小鼠移植瘤大小
        7.2.4 HE染色檢測腫瘤組織壞死及肺轉(zhuǎn)移情況
        7.2.5 RT-qPCR檢測CAFs標(biāo)志物、自噬標(biāo)志物及EMT標(biāo)志物mRNA的表達(dá)
        7.2.6 Western blotting檢測EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)
        7.2.7 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析
    7.3 結(jié)果
        7.3.1 小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1與成纖維細(xì)胞NIH3T3混合接種促進(jìn)腫瘤的生長
        7.3.2 小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1與成纖維細(xì)胞NIH3T3混合接種減少了腫瘤壞死
        7.3.3 小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1與成纖維細(xì)胞NIH3T3混合接種豐富了CAFs標(biāo)志物mRNA的表達(dá)
        7.3.4 小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1與成纖維細(xì)胞NIH3T3混合接種豐富了自噬標(biāo)志物mRNA的表達(dá)
        7.3.5 小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1與成纖維細(xì)胞NIH3T3混合接種促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)(EMT)的轉(zhuǎn)變
        7.3.6 小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1與成纖維細(xì)胞NIH3T3混合接種促進(jìn)腫瘤向肺轉(zhuǎn)移
    7.4 小結(jié)與討論
第8章 結(jié)論與展望
    8.1 結(jié)論
    8.2 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)



本文編號：3976920