發(fā)布時間：2024-03-02 10:11

　　近年來,利用重組病毒對T細胞進行基因編輯用于免疫治療,受到了廣泛重視。然而,重組病毒因存在隨機整合,制備耗時長且昂貴的缺點制約了其應用。與此同時,電轉染技術的應用能夠快速將外源DNA帶入細胞內(nèi),有助于提高T細胞基因編輯效率。TET(Ten-eleven translocation)家族蛋白可以催化5-甲基胞嘧啶(5mC)轉化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC),5hmC作為細胞中的DNA去甲基化酶,在細胞基因組表觀遺傳學中起著重要調(diào)控作用。研究表明TET2基因的缺失能夠促進CAR-T細胞的快速繁殖,產(chǎn)生強力的CAR-T細胞。該研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對TET2基因進行敲除。首先對sgRNA進行體外轉錄,與大腸桿菌誘導表達的Cas9蛋白孵育形成Cas9:gRNA核糖核蛋白復合物(RNP),并在體外酶切驗證sgRNA的活性。接著利用電轉染技術將Cas9:gRNA核糖核蛋白復合物(RNP)帶入細胞內(nèi),并檢測T細胞基因編輯效率。最后利用流式細胞分析技術檢測T細胞的增殖情況�；驕y序與T7EⅠ酶切結果表明,T細胞中的TET2基因被成功敲除,T細胞活力和功能并未受到影響。流式細胞技術,...

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【部分圖文】：

圖4T細胞TET2基因敲除驗證

本研究構建了攜帶有核定位信號的Cas9蛋白表達載體，在大腸桿菌蛋白表達系統(tǒng)中誘導Cas9蛋白表達。由于大腸桿菌蛋白表達系統(tǒng)均有操作方便快捷、時間周期短、獲得蛋白量大等特點，能夠在短時間內(nèi)獲得大量的Cas9蛋白。人為在Cas9蛋白C端融合表達了6個組氨酸，His標簽能夠特異性的與N....

圖5臺盼藍計數(shù)檢測細胞增殖

圖4T細胞TET2基因敲除驗證圖6CCK-8細胞計數(shù)檢測細胞活力

圖1Cas9蛋白表達與純化

PBMC中分離純化的T細胞在電轉染2d內(nèi)，細胞由于電穿孔損傷會使部分細胞死亡，活細胞數(shù)量統(tǒng)計顯示死亡率為42.1%，在培養(yǎng)基中加入IL-2、CD28等細胞因子的刺激下T細胞培養(yǎng)2d后開始增殖。之前研究表明T細胞在體外生長一段時間，隨著時間的延長T細胞會逐漸死亡。在T細胞中敲除....

圖2Cas9和gRNA體外酶切活性鑒定

T淋巴細胞作為人體細胞免疫的重要成分，T細胞在淋巴細胞中數(shù)量最多，其由胸腺內(nèi)的淋巴干細胞分化而成，為功能最復雜的一類細胞。T細胞行使正常功能對人類抵御疾病非常重要，2012年美國科學家以HIV病毒為載體將T細胞進行改造使其可以殺傷人體內(nèi)白血病細胞。CAR-T免疫細胞治療主要以慢病....

本文編號：3916719