硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase,TrxR)是一類重要的抗氧化硒蛋白,參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展。研究表明,萘醌類分子可以靶向抑制TrxR1活性并經(jīng)由TrxR1介導(dǎo)產(chǎn)生活性氧,導(dǎo)致細(xì)胞氧化還原失衡,使其成為潛在的腫瘤化療藥物。本文旨在通過生物化學(xué)及質(zhì)譜分析,探究硒蛋白TrxR1與萘醌化合物甲萘醌的相互作用,進(jìn)一步揭示TrxR1催化萘醌分子還原的機(jī)理和萘醌分子抑制TrxR1活性的機(jī)制。通過對(duì)TrxR1催化殘基的定點(diǎn)突變和突變體的重組表達(dá),我們測(cè)定TrxR1突變體介導(dǎo)甲萘醌還原穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù),并分析甲萘醌對(duì)TrxR1活性抑制,最后通過質(zhì)譜分析鑒定甲萘醌與TrxR1相互作用。結(jié)果表明,硒蛋白TrxR1的Sec498催化甲萘醌還原,但是U498C突變使甲萘醌還原更加高效,表明了甲萘醌還原主要呈現(xiàn)非硒依賴性。突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C端Cys498發(fā)揮主要催化還原作用,而N端Cys64對(duì)甲萘醌還原的影響稍強(qiáng)于Cys59。LC-MS結(jié)果發(fā)現(xiàn)TrxR1存在1分子甲萘醌加合物,推測(cè)其不可逆修飾硒蛋白C末端高反應(yīng)活性的硒代半胱氨酸。本研究揭示了TrxR1可以非硒依賴方式催化甲萘醌還原,同時(shí)其活...

【文章頁數(shù)】：12 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料與儀器
    1.2 重組大鼠Trx R1定點(diǎn)突變體的質(zhì)粒構(gòu)建
    1.3 Trx R1及突變體蛋白的表達(dá)
    1.4 Trx R1及突變體蛋白的純化
    1.5 Trx R1突變體蛋白濃度測(cè)定
    1.6 Trx R1及突變體蛋白的電泳分析
    1.7 以甲萘醌為底物的穩(wěn)態(tài)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析
    1.8 甲萘醌抑制Trx R1活力測(cè)定
    1.9 LC/MS分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 重組大鼠Trx R1活性位點(diǎn)突變
    2.2 重組大鼠Trx R1突變體蛋白的制備
    2.3 Trx R1及其突變體的活性檢測(cè)
    2.4 以甲萘醌為底物的穩(wěn)態(tài)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)
    2.5 Trx R1位點(diǎn)突變檢測(cè)甲萘醌還原反應(yīng)
    2.6 GR還原甲萘醌的穩(wěn)態(tài)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)
    2.7 甲萘醌對(duì)Trx R1的抑制作用
    2.8 甲萘醌對(duì)Trx R1靶向結(jié)合的質(zhì)譜分析
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本文編號(hào)：3878300