目的:膀胱癌是發(fā)生在膀胱黏膜層的上皮性腫瘤。膀胱癌發(fā)病率較高,是我國最常見的泌尿系腫瘤。膀胱癌對傳統(tǒng)的放療化療并不敏感,且由于膀胱癌細胞生物表型上的多樣性,高病理分期的膀胱癌治療效果及預后均不理想。新型分子靶向藥物,通過激活抑癌基因或抑制癌基因的表達,降低膀胱癌的復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移。近年來,許多研究發(fā)現(xiàn)UNC5B是P53的直接靶基因,UNC5B可在缺少netrin-1結(jié)合或其自身過表達時,介導細胞凋亡并抑制細胞增殖。同時,UNC5B在多種腫瘤中具有抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲的生物學效應,并可增強化療藥對腫瘤的敏感性。本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)譜分析和免疫沉淀實驗鑒定UNC5B結(jié)合的相關(guān)結(jié)合蛋白,通過生物信息學分析其激活的分子通路及重要靶點,綜合利用流式細胞技術(shù)、基因敲減技術(shù)及體內(nèi)實驗,深入探索UNC5B調(diào)控膀胱癌細胞周期、抑制腫瘤增殖的分子機制。方法:1.確定UNC5B在膀胱癌組織及膀胱癌細胞中的內(nèi)源性表達。在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科的病理標本庫中,選取20對經(jīng)病理報告確認的膀胱癌與癌旁組織。應用PCR和WB法檢測UNC5B在膀胱癌標本。用同樣方法檢測7種膀胱癌細胞器中UNC5...

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文略縮語
第一部分:UNC5B通過調(diào)控細胞周期抑制膀胱癌細胞的增殖
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 臨床資料及實驗材料
            2.1.1 臨床資料來源
        2.2 實驗試劑所需要主要儀器,藥品,試劑
            2.2.1 實驗用膀胱癌細胞系
            2.2.2 實驗儀器
            2.2.3 實驗試劑
        2.3 試驗方法
            2.3.1 免疫印跡（Western Blot）
            2.3.2 實時定量PCR
            2.3.3 細胞培養(yǎng)
            2.3.4 流式細胞儀測定細胞周期
            2.3.5 免疫熒光
            2.3.6 流式細胞儀測活細胞免疫熒光
            2.3.7 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞
            2.3.8 慢病毒轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞
            2.3.9 諾考達唑同步化膀胱癌細胞周期及細胞周期檢測
            2.3.10 RCTA法檢測細胞增殖曲線
            2.3.11 UNC5B質(zhì)粒胞內(nèi)段的克隆構(gòu)建
            2.3.12 統(tǒng)計學分析
    3 結(jié)果
        3.1 PCR顯示UNC5B在膀胱癌中是抑癌因子
        3.2 PCR確定UNC5B在各細胞中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
        3.3 Western Blot確定UNC5B的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
        3.4 熒光鏡確定UNC5B在細胞中的轉(zhuǎn)染
        3.5 流式細胞熒光技術(shù)確定UNC5B的轉(zhuǎn)染
        3.6 UNC5B胞內(nèi)段真核表達體的構(gòu)建
        3.7 RCTA顯示全長UNC5B抑制膀胱癌細胞增殖
        3.8 GO分析顯示UNC5B抑制細胞增殖與周期調(diào)控相關(guān)
        3.9 全長UNC5B介導了膀胱癌細胞的G2/M周期阻滯
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分: UNC5B通過結(jié)合CDC14A與 P53 磷酸化P53 介導G2/M周期阻滯
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實驗試劑所需要主要儀器,藥品,試劑
            2.1.1 實驗用膀胱癌細胞系
            2.1.2 實驗儀器
            2.1.3 實驗試劑
        2.2 試驗方法
            2.2.1 免疫印跡(Western Blot)
            2.2.2 實時定量PCR
            2.2.3 免疫共沉淀(CO-IP)試驗
            2.2.4 快速銀染法鑒定差異蛋白
            2.2.5 蛋白質(zhì)譜鑒定及生信分析
            2.2.6 異種移植瘤模型
            2.2.7 免疫組化
            2.2.8 統(tǒng)計學分析
    3 結(jié)果
        3.1 快速銀染法檢測組間的差異蛋白
        3.2 PPI分析顯示了UNC5B介導周期阻滯的蛋白互作模式
        3.3 KEGG分析顯示CDC14A是介導周期阻滯的關(guān)鍵蛋白
        3.4 TCGA數(shù)據(jù)庫顯示CDC14A與膀胱癌的相關(guān)性
        3.5 CO-IP證實CDC14A和 P53 可以結(jié)合UNC5B
        3.6 過表達UNC5B通過去磷酸化P53介導相關(guān)周期蛋白的改變
        3.7 動物實驗證實UNC5B的體內(nèi)抑癌效應
        3.8 免疫組化驗證UNC5B的抑癌效應
    4 討論
    5 結(jié)論
第三部分: 敲除CDC14A抑制UNC5B介導的周期阻滯并降低了UNC5B的體內(nèi)抑癌效應.
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實驗試劑所需要主要儀器,藥品,試劑
            2.1.1 實驗用膀胱癌細胞系
            2.1.2 實驗儀器
            2.1.3 實驗試劑
        2.2 試驗方法
            2.2.1 免疫印跡(Western Blot)
            2.2.2 實時定量PCR
            2.2.3 細胞培養(yǎng)
            2.2.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞
            2.2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞
            2.2.6 RCTA法檢測細胞增殖曲線
            2.2.7 流式細胞儀測定細胞周期
            2.2.8 異種移植瘤模型
            2.2.9 免疫組化
            2.2.10 統(tǒng)計學分析
    3 結(jié)果
        3.1 CDC14A的成功敲減
        3.2 CDC14A的敲減抑制了UNC5B介導的G2/M周期阻滯效應
        3.3 CDC14A的敲減與細胞周期蛋白的表達相關(guān)
        3.4 CDC14A敲減回復了UNC5B在5637 細胞中的周期抑制效應
        3.5 CDC14A敲減回復了UNC5B在 T24 細胞中的周期抑制效應
        3.6 CDC14A的敲減降低了UNC5B的體內(nèi)抑癌效應
        3.7 CDC14A的敲減增加了Ki67 的表達,降低了P53 的表達
        3.8 UNC5B通過CDC14A及 P53 介導周期阻滯的效應圖
    4 討論
    5 結(jié)論
本論文創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷



本文編號：3870188