目的:構(gòu)建F-actin結(jié)合結(jié)構(gòu)域(F-actin binding domain,FABD)缺失腺病毒載體Ad-Bcr/Abl-ΔFABD和野生型Bcr/Abl腺病毒載體Ad-Bcr/Abl,探討FABD結(jié)構(gòu)域?qū)cr/Abl蛋白定位及功能的影響。方法:PCR擴(kuò)增bcr/abl和bcr/abl-ΔFABD片段,雙酶切后克隆至穿梭質(zhì)粒p Ad Track-CMV,經(jīng)Ad Easy構(gòu)建系統(tǒng)獲得腺病毒Ad-Bcr/Abl-ΔFABD和Ad-Bcr/Abl,并在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行包裝。將細(xì)胞分為3組,Ad-GFP組、Ad-Bcr/Abl組以及Ad-Bcr/Abl-ΔFABD組,分別加入對(duì)應(yīng)的腺病毒。Western blot驗(yàn)證Bcr/Abl和Bcr/Abl-ΔFABD在293T細(xì)胞中的表達(dá)水平,間接免疫熒光法檢測(cè)Bcr/Abl和Bcr/Abl-ΔFABD在293T細(xì)胞中的定位。流式細(xì)胞術(shù)、MTT法分別檢測(cè)Bcr/Abl和Bcr/Abl-ΔFABD對(duì)293T細(xì)胞凋亡、增殖的影響。結(jié)果:雙酶切以及測(cè)序驗(yàn)證穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確;PacⅠ酶切驗(yàn)證重組腺病毒質(zhì)粒重組成功;綠色熒光顯示重組腺病毒包裝成功;...

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【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料與試劑
    1.2 引物設(shè)計(jì)與合成
    1.3 目的基因的擴(kuò)增
    1.4 腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
    1.5 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建
    1.6 腺病毒的包裝和擴(kuò)增
    1.7 Bcr/Abl和Bcr/Abl-ΔFABD蛋白的表達(dá)驗(yàn)證
    1.8 Bcr/Abl和Bcr/Abl-ΔFABD蛋白的細(xì)胞定位
    1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Bcr/Abl和Bcr/Abl-ΔFABD對(duì)293T細(xì)胞凋亡的影響
    1.1 0 MTT法檢測(cè)Bcr/Abl和Bcr/Abl-ΔFABD對(duì)293T細(xì)胞增殖的影響
    1.1 1 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 重組腺病毒質(zhì)粒p Ad-Bcr/Abl、p Ad-Bcr/Abl-ΔFABD的構(gòu)建及鑒定
    2.2 重組腺病毒Ad-Bcr/Abl、Ad-Bcr/Abl-ΔFABD的包裝、擴(kuò)增及目的蛋白的鑒定
    2.3 FABD對(duì)Bcr/Abl蛋白細(xì)胞定位的影響
    2.4 FABD對(duì)Bcr/Abl蛋白抗凋亡、促增殖能力的影響
3 討論



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