本文關(guān)鍵詞：stTRAIL-納米金復(fù)合物促進(jìn)熱休克肝癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的和意義:利用化學(xué)還原法制備了聚乙烯亞胺修飾的納米金基因載體并研究其理化性質(zhì)、表征參數(shù)及細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)靜電吸附作用將納米金基因載體與含st TRAIL目的基因片段的重組質(zhì)粒DNA按一定質(zhì)量比結(jié)合構(gòu)建了st TRAIL-納米金復(fù)合物,并應(yīng)用該復(fù)合物聯(lián)合熱休克處理肝癌細(xì)胞,觀(guān)察其對(duì)熱休克肝癌細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞凋亡等的影響,并探討st TRAIL-納米金復(fù)合物促進(jìn)熱休克肝癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。方法:1.利用化學(xué)還原法制備聚乙烯亞胺修飾的納米金基因載體,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)納米金顆粒的吸收光譜及最大吸收峰處波長(zhǎng),在透射電鏡下觀(guān)察納米金顆粒的表觀(guān)形貌特征,用激光粒度儀檢測(cè)納米金顆粒的粒徑大小及其分布,用表面電位儀檢測(cè)納米金顆粒的表面電位(Zeta電位),用1%的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)納米金基因載體與質(zhì)粒DNA的結(jié)合穩(wěn)定性,CCK-8試劑盒檢測(cè)聚乙烯亞胺修飾納米金基因載體及DNA-納米金復(fù)合物對(duì)HEK293細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用,通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察聚乙烯亞胺納米基因載體介導(dǎo)p Ac GFP-N1在體外培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞中的表達(dá),并分析其轉(zhuǎn)染效率。2.將納米金基因載體與含stTRAIL目的基因片段的重組質(zhì)粒DNA按不同質(zhì)量比混合,1%瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)st TRAIL-納米金復(fù)合物結(jié)合的穩(wěn)定性,CCK-8試劑盒檢測(cè)其對(duì)SMMC7721細(xì)胞的細(xì)胞毒性,確定納米金與重組質(zhì)粒DNA結(jié)合的最佳質(zhì)量比。st TRAIL-納米金復(fù)合物聯(lián)合熱休克處理肝癌細(xì)胞后,用CCK-8試劑盒檢測(cè)其對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721的增殖活性的影響,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該復(fù)合物聯(lián)合熱休克處理肝癌細(xì)胞后促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。3.Real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)TRAIL信號(hào)通路下游Caspase-8、Caspase-3的mRNA、蛋白質(zhì)水平的表達(dá)差異,探討st TRAIL-納米金復(fù)合物促進(jìn)熱休克肝癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果:1.聚乙烯亞胺還原氯金酸可以得到表面帶正電荷的納米金顆粒,呈單分散球形分布,其粒徑為12.3±3.3 nm。在PH=7.2時(shí),Zeta電位為+(29.7±5.1)m V。1%瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)納米金/質(zhì)粒DNA≥0.5時(shí),質(zhì)粒DNA可完全結(jié)合到納米金表面。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明,聚乙烯亞胺修飾納米金基因載體能介導(dǎo)p Ac GFP-N1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白,其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)25%。2.瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)納米金/質(zhì)粒DNA≥0.5時(shí),重組質(zhì)粒DNA可完全結(jié)合到納米金顆粒表面。CCK-8試驗(yàn)表明,納米金與重組質(zhì)粒DNA按質(zhì)量比5:1結(jié)合時(shí)形成的復(fù)合物相對(duì)穩(wěn)定,且對(duì)細(xì)胞毒性較弱,最適合轉(zhuǎn)染st TRAIL基因。用按此比例結(jié)合的stTRAIL-納米金復(fù)合物聯(lián)合熱休克處理肝癌細(xì)胞,能明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖活性,顯著地促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。3.Real-time PCR結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)st TRAIL-納米金復(fù)合物聯(lián)合熱休克處理的肝癌細(xì)胞組,TRAIL信號(hào)通路下游Caspase-8、Caspase-3的mRNA表達(dá)明顯增高。Western blot結(jié)果同樣表明,實(shí)驗(yàn)組TRAIL信號(hào)信號(hào)通路下游Caspase-8、Caspase-3等蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)論:通過(guò)化學(xué)合成的納米金基因載體具備制備簡(jiǎn)便、成本低、轉(zhuǎn)染效率較高的特點(diǎn)。2.st TRAIL-納米金復(fù)合物按質(zhì)量比5:1結(jié)合較穩(wěn)定,能夠轉(zhuǎn)染st TRAIL基因。該復(fù)合物能夠在熱休克條件下能夠顯著地抑制肝癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。3.st TRAIL-納米金復(fù)合物促進(jìn)熱休克肝癌細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)納米金載體遞送TRAIL基因,使TRAIL基因過(guò)表達(dá),上調(diào)TRAIL信號(hào)通路,促使下游凋亡相關(guān)分子Caspase-8、Caspase-3等表達(dá)增加,從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：肝癌 TRAIL 納米金 熱休克 凋亡
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 英文摘要7-10
• 中文摘要10-12
• 第一章 前言12-15
• 1.1 研究背景12
• 1.2 研究意義12-13
• 1.3 可行性分析13-14
• 1.4 研究方法14
• 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析14-15
• 第二章 聚乙烯亞胺修飾納米金基因載體的制備及鑒定15-25
• 2.1 引言15-16
• 2.2 材料與方法16-18
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法18-19
• 2.4 結(jié)果19-23
• 2.5 討論23-24
• 2.6 結(jié)論24-25
• 第三章 stTRAIL-納米金復(fù)合物促進(jìn)熱休克肝癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究25-45
• 3.1 引言25
• 3.2 材料與方法25-29
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法29-37
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-43
• 3.5 討論43-44
• 3.6 結(jié)論44-45
• 全文總結(jié)45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 文獻(xiàn)綜述 TRAIL在肝癌治療中的應(yīng)用進(jìn)展50-57
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 攻讀學(xué)位期間取得的主要研究成果57-58
• 致謝58

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本文編號(hào)：374712