結(jié)直腸癌致死率和發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì),是人類第三大惡性腫瘤。除了傳統(tǒng)的手術(shù)及放化療手段,基于腫瘤新生抗原的個(gè)體化腫瘤疫苗是新興的抗腫瘤療法。腫瘤新抗原源自體細(xì)胞突變,由于其在正常組織中不表達(dá)而具有腫瘤特異性。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)結(jié)腸癌新抗原的研究相對(duì)較少。相比當(dāng)前癌癥研究的臨床前免疫缺陷小鼠模型,斑馬魚(yú)（Danio rerio）具有與人類基因組高同源、短周期、高通量、體內(nèi)動(dòng)態(tài)可視、發(fā)育前期無(wú)適應(yīng)性免疫、以及低成本等優(yōu)勢(shì),逐漸發(fā)展成另一相對(duì)快速且具有較高成本效益的人類癌癥體內(nèi)模型。據(jù)此,本研究旨在構(gòu)建簡(jiǎn)便有效的篩選及鑒定結(jié)腸癌新抗原的新平臺(tái),并期望應(yīng)用該模型獲得候選靶點(diǎn)抗原。我們依賴于斑馬魚(yú)異種移植的能力來(lái)揭示效靶細(xì)胞在其體內(nèi)的免疫原性及殺傷活性,因此我們（1）構(gòu)建斑馬魚(yú)移植瘤模型,將CM-Dil標(biāo)記的T2-A24細(xì)胞顯微注射入受精后2天（days post fertilization,dpf）的斑馬魚(yú)體內(nèi),培養(yǎng)4天,發(fā)現(xiàn)T2-A24細(xì)胞具有在斑馬魚(yú)體內(nèi)增殖的能力;（2）為了確定合適的效靶細(xì)胞比例,顯微注射CM-Dil標(biāo)記的不同數(shù)量外周血單核細(xì)胞（peripheral blood monon... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

T2-A24模式靶細(xì)胞在斑馬魚(yú)體內(nèi)呈現(xiàn)增殖潛能CM-Dil染料標(biāo)記T2-A24細(xì)胞，顯微注射100個(gè)細(xì)胞到2dpf斑馬魚(yú)胚胎卵黃囊中

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文3結(jié)果18圖3.2PBMC可在斑馬魚(yú)體內(nèi)穩(wěn)定存在一周左右CM-Dil染料標(biāo)記PBMC細(xì)胞，分別顯微注射1000/500/250個(gè)細(xì)胞到2dpf斑馬魚(yú)胚胎卵黃囊中。在注射后0/2/4/6/8天內(nèi)，每天統(tǒng)計(jì)胚胎的存活率，并隨機(jī)選取其中的胚胎，將其置于熒光顯微鏡下觀察。（A）斑馬魚(yú)體內(nèi)異種移植細(xì)胞0/2/4/6/8天，具有代表性的斑馬魚(yú)模型的熒光圖，放大倍數(shù)均為40×；（B）移植0/2/4/6/8天，各組別斑馬魚(yú)胚胎的存活率。3.3構(gòu)建效靶細(xì)胞同時(shí)注射-斑馬魚(yú)移植瘤免疫干預(yù)模型3.3.1AKF9體外免疫原性驗(yàn)證為了建立構(gòu)建斑馬魚(yú)移植瘤免疫干預(yù)模型的方法，我們選擇了文獻(xiàn)中已報(bào)道的能與HLA-A*24:02分子強(qiáng)結(jié)合的多肽AKF9（AYLEAIHKF）[41]。我們利用T2-binding實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AKF9與HLA-A*24:02分子的結(jié)合力，ELISpot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞水平分泌IFN-γ的CTL數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AKF9處理組FI值大于1.5，說(shuō)明AKF9與HLA-A*24:02有強(qiáng)結(jié)合力（如圖3.3A），與文獻(xiàn)報(bào)道一致。體外誘導(dǎo)T細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)AKF9的免疫原性，發(fā)現(xiàn)AKF9處理組斑點(diǎn)數(shù)遠(yuǎn)大于Blank組，且P值小于0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（如圖3.3B-C）。根據(jù)以上結(jié)果，我們認(rèn)為AKF9如相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，具有一定的體外免疫原性，因此可以選為我們建模方法中的陽(yáng)性肽。

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文3結(jié)果19圖3.3AKF9體外免疫原性驗(yàn)證T2-A24細(xì)胞與AKF9共孵育16-18小時(shí)。PMBC負(fù)載AKF9，添加IL-2后培養(yǎng)12天，分別收集細(xì)胞。（A）對(duì)于收集的T2-A24細(xì)胞，加入適量的Anti-HLA-A24(Human)mAb-FITC抗體孵育，PBS洗滌后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)AKF9與HLA-A*24:02分子的結(jié)合力。其中CEF20為陰性對(duì)照，Blank為空白對(duì)照。FI為熒光系數(shù)，若FI>1.5，則待測(cè)肽與HLA-A分子具有強(qiáng)結(jié)合力；1.0<FI<1.5，中等結(jié)合力；0.5<FI<1，弱結(jié)合力；FI<0.5，無(wú)結(jié)合力；（B）對(duì)于收集的T2-A24和PBMC細(xì)胞，用ELISpot試劑盒檢測(cè)負(fù)載抗原的DC誘導(dǎo)的CTL數(shù)。其中Blank為陰性對(duì)照，Medium為空白對(duì)照；（C）對(duì)（B）的定量統(tǒng)計(jì)分析，SFC/106PBMCs表示為反應(yīng)強(qiáng)度。C中結(jié)果表示為Mean±SEM，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001。


本文編號(hào)：3573071