腫瘤對人類生命和健康造成了重大威脅，而轉(zhuǎn)基因小鼠已成為研究各種腫瘤形成機制的有力工具。聯(lián)合應用四環(huán)素誘導系統(tǒng)和Cre/LoxP系統(tǒng)的高效且無毒的誘導基因表達調(diào)控系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的。其應用在轉(zhuǎn)基因小鼠上，實現(xiàn)了對外源基因時空表達的可控，使得小鼠腫瘤模型更接近實際情況,更高效地解析腫瘤的發(fā)生機制。人類腫瘤中最常見的癌基因異常是ras基因突變,其中對人類影響較大的是K-ras基因突變。為深入研究K-ras基因突變致癌的發(fā)生機制，以期達到治療腫瘤的目的，需精確調(diào)控K-ras突變基因的時空表達，建立合適的腫瘤模型。在實驗室已有的四環(huán)素誘導系統(tǒng)的反應元件TRE-Kras-G12D小鼠前提下，需要再構(gòu)建調(diào)控元件轉(zhuǎn)基因小鼠，通過這兩種小鼠交配所得雙陽性小鼠，誘導Kras G12D蛋白的表達。而本文的主要工作就是基于Cre/LoxP和四環(huán)素誘導系統(tǒng)原理，構(gòu)建出可潛在高表達tTA蛋白的CL-tTA轉(zhuǎn)基因小鼠，可作為實驗室的轉(zhuǎn)基因工具鼠，為構(gòu)建不同癌基因腫瘤模型打下基礎(chǔ)。本文主要是通過分子生物學常用技術(shù)構(gòu)建pClkhl-tTA-IRES-GFP重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)ES細胞，用潮霉素B和他莫昔芬篩選出高表達的E... 

【文章來源】：山東師范大學山東省

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

pWPI-tTA質(zhì)粒雙酶切電泳圖

M 1 2 6 23圖 2-3 pClkhl-tTA-IRES-GFP 和 pClhl-tTA-IRES-GFP 質(zhì)粒菌落 PCR 圖用 T4 連接酶處理 tTA 片段與線性化 pClhl-IRES-GFP 和 pClkhl- IRES-GFP 片段，后，用引物 ptTA-R 和 ptTA-F 進行菌落 PCR 鑒定。PCR 所得片段大小為 250bp 左24 個克隆里得到 3 個 pClkhl-tTA-IRES-GFP 陽性克隆和 1 個 pClhl-tTA-IRES-GFP 陽。選 2 號和 23 號用到克隆進行擴大培養(yǎng)，以備進一步測序鑒定。 pClkhl-tTA-IRES-GFP 和 pClhl-tTA-IRES-GFP 質(zhì)粒測序?qū)蓚�克隆提取質(zhì)粒，送到公司測序，測序結(jié)果與質(zhì)粒圖譜序列比對一致。 電轉(zhuǎn)所需片段的獲取

圖3-1兩種目的片段克隆總數(shù)柱狀

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3556366