目的探討miR-10a對結腸癌肝轉移微環(huán)境中肝成纖維細胞的影響及分子機制,揭示miR-10a誘導的肝成纖維細胞功能改變對結腸癌細胞在肝形成轉移灶的影響,為結腸癌肝轉移的分子機制提供新的理論基礎。方法1用TGF-β1處理肝星狀細胞系LX-2（命名為TGF-LX-2細胞）48 h,通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（Quantitative real time fluorescene polymerase chain reaction,qRT-PCR）實驗檢測LX-2細胞和TGF-LX-2細胞中α-SMA和miR-10a的表達差異;TGF-LX-2細胞中過表達miR-10a,采用CCK-8實驗、Transwell實驗和酶聯免疫吸附實驗（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測各組細胞的增殖、遷移能力和促炎因子IL-6和IL-8的分泌水平。2收集過表達miR-10a的TGF-LX-2細胞和其對照組條件培養(yǎng)基作用于結腸癌細胞系SW480,通過CCK-8實驗、劃痕實驗、Transwell實驗、細胞-基質粘附實驗和成球實驗檢測兩組細胞的條件培養(yǎng)基對SW480細... 

【文章來源】：華北理工大學河北省

【文章頁數】：61 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

qRT-PCR實驗檢測TGF-β1處理LX-2細胞48小時后α-SMA的表達（n=3,x±s）

-19-通過CCK-8實驗分析轉染miR-10amimics和miR-10aNC對TGF-LX-2細胞增殖能力的影響。轉染24h后，將細胞從新接種至96孔板，檢測第1-4d的細胞活性。結果顯示，miR-10amimics組細胞在第2、3、4d的增殖能力顯著低于同時期的miR-10aNC組細胞（t=3.323,P=0.029;t=3.711,P=0.021;t=6.498,P=0.003；圖4）。以上結果表明過表達miR-10a可抑制TGF-LX-2細胞的增殖。注：*：P<0.05,**：P<0.01，與對照組比較圖4CCK-8實驗檢測過表達miR-10a對TGF-LX-2細胞增殖能力的影響（n=3,x±s）通過Transwell（無基質膠）分析轉染miR-10amimics和miR-10aNC對TGF-LX-2細胞遷移能力的影響。轉染24h后，將細胞接種于Transwell小室，24h后觀察細胞遷移情況。結果顯示，miR-10amimics組細胞穿過基底膜（無基質膠）的細胞數（42±2.03）顯著低于同時期的miR-10aNC組細胞（72±3.28）（t=7.861,P=0.001,圖5）。以上結果表明過表達miR-10a可抑制TGF-LX-2細胞的遷移。注：左圖為代表性實驗結果；右圖為每視野細胞計數結果的平均值，**：P<0.01，與對照組比較圖5Transwell實驗（無基質膠）檢測過表達miR-10a對TGF-LX-2細胞遷移能力的影響（n=3,x±s）

-21-CM）對結腸癌SW480細胞增殖能力的影響。用50%TGF-LX-2-10a/NCCM+50%MEM-α重懸SW480細胞，隨后將其接種至96孔板，檢測第1~4d的細胞活性。結果顯示，TGF-LX-2-10a/NCCM處理后SW480細胞的增殖能力無顯著性差異（P>0.05,圖7）。以上結果表明過表達miR-10a的TGF-LX-2細胞的培養(yǎng)基對SW480細胞的增殖能力無影響。注：條件培養(yǎng)基（conditionedmedium,CM）圖7CCK-8實驗檢測TGF-LX-2-10aCM對SW480細胞增殖能力的影響（n=3,x±s）2）TGF-LX-2-10a的培養(yǎng)基抑制SW480細胞的遷移和侵襲能力通過劃痕實驗分析TGF-LX-2-10aCM對SW480細胞遷移能力的影響。50%TGF-LX-2-10a/NCCM+50%MEM-α處理SW480細胞24h后，用200μL的槍頭在孔內制造劃痕，隨后將培養(yǎng)基更換成無血清MEM-α培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察拍照，記錄0h、24h和48h在同一位置的細胞劃痕情況。結果顯示，TGF-LX-2-10aCM處理的SW480細胞在第24h和48h的遷移能力顯著低于同時期的TGF-LX-2-NCCM處理的細胞（t=5.645,P=0.005;t=5.866,P=0.004；圖8）。以上結果表明過表達miR-10a的TGF-LX-2細胞的培養(yǎng)基可抑制SW480細胞的遷移。


本文編號：3525143