目的:本研究通過對人結(jié)腸癌全外顯子測序的生物信息學(xué)分析,預(yù)測新抗原,確定其所結(jié)合的MHC（人類為HLA）分子親和力。體外模擬抗原提呈過程對腫瘤新生抗原肽進行免疫原性檢測,闡述新抗原肽的免疫原性與其MHCⅠ類分子親和力變化度及MHCⅠ等位基因型之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上形成快速發(fā)現(xiàn)有效新抗原的新方法。方法:1.采用NGS測序技術(shù)對患者腫瘤組織進行全外顯子測序,獲得腫瘤的全外顯子基因組數(shù)據(jù)。2.通過Net-MHC4.0等軟件預(yù)測（9肽）新抗原肽,確定其所結(jié)合的MHC I等位基因和分子親和力。3.由生物公司根據(jù)新抗原多肽的氨基酸序列,合成新抗原多肽。4.體外誘導(dǎo)外周血單個核細胞（PBMC）分化為未成熟樹突狀細胞（im DC）。5.制備負載新抗原多肽的DC疫苗。6.進行DC疫苗與PBMC共培養(yǎng)。7.采用ELISPOT酶聯(lián)斑點技術(shù)量化新抗原多肽的免疫原性。8.以流式細胞技術(shù)鑒定成熟樹突狀細胞（m DC）及最后共培養(yǎng)混合細胞中T、B、NK等各免疫細胞的百分比。結(jié)果:1.通過NGS測序技術(shù)及生物信息分析技術(shù)預(yù)測了共222種新抗原肽（來自6例結(jié)腸癌患者標本）,明確了其等位基因及其MHC分子親和力等信息。2... 

【文章來源】：杭州師范大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

淋巴分離示意圖

杭州師范大學(xué)碩士學(xué)位論文實驗材料及方法13圖2-2CD8+T細胞識別負載新抗原多肽的DC細胞簡單示意圖圖2-2.新抗原結(jié)合HLA分子后，被APC提呈至細胞表面，最后被CDT8+T細胞表面的TCR識別，該過程即為新抗原多肽的免疫應(yīng)答過程。2.2.6EliSpot酶聯(lián)斑點技術(shù)測T細胞的活性1）排板設(shè)計：每個細胞懸液設(shè)置2個復(fù)孔,對照組為新制備的PBMC，同時設(shè)置試劑質(zhì)控組，即由INF-γ刺激的細胞懸液做陽性對照及單純培養(yǎng)基做陰性對照。2）用200μLRPMI1640培養(yǎng)基填充微孔板中的所有孔，并在室溫下孵育約20min。3）收集最后全部混合細胞后，1500rpm，離心5min，用RPMI1640培養(yǎng)基重懸再清洗1次，最后將細胞懸液的容量調(diào)整為200ul。4）準備好接種細胞后，將孔中培養(yǎng)基吸出，立即向每個孔中加入200μl混合細胞。5）將細胞在潮濕的培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中孵育24小時。

杭州師范大學(xué)碩士學(xué)位論文實驗結(jié)果173.2成功制備92種新抗原多肽混合DC細胞疫苗在誘導(dǎo)分化DC的過程中，分別于正置電子顯微鏡和倒置光學(xué)顯微鏡進行照片采集，圖3-1為細胞在正置電子顯微鏡下由LeicaApplicationSuite(LAS)軟件進行的圖像采集，圖3-2為倒置光學(xué)顯微鏡下由電子攝像機拍攝圖像。圖3-1正置電子顯微鏡下電腦軟件所采集圖像圖3-1.從外周血中分離出的PBMC讓其自然貼壁，棄去懸浮細胞，留貼壁的單核細胞培養(yǎng)，用細胞因子GM-CSF和IL4誘導(dǎo)單核細胞分化為DC。A-E組圖為電子顯微鏡下由電腦軟件采集的圖片，A組圖為D1天去懸浮細胞后貼壁生長的圓形單核細胞；B組圖為D2天開始成團生長的貼壁細胞；C組圖為D3天成團生長的貼壁細胞開始伸出偽足；D組圖為D5天可見多種形態(tài)、不同偽足的半懸浮細胞，此時即為未成熟樹突狀細胞（imDC）；E組圖為經(jīng)抗原肽、CPG佐劑刺D1,50×D1,100×D1,200×D1,400×D2,50×D2,100×D2,200×D2,400×D3,50×D3,100×D3,200×D3,400×D5,50×D5,100×D5,200×D5,400×D7,50×D7,100×D7,200×D7,400×ABCDE

【參考文獻】：
期刊論文
[1]腫瘤抗原肽研究新進展[J]. 劉曉軍,殷小平,翁謝川,隋延仿.  國外醫(yī)學(xué)(生理、病理科學(xué)與臨床分冊). 2000(03)



本文編號：3503192