目的:黑色素瘤患者對靶向藥物容易產(chǎn)生耐藥是目前困擾醫(yī)學(xué)界的一大難題。Library文庫篩選具有高通量、省時、經(jīng)濟(jì)等特點。本研究中,我們利用自主構(gòu)建的覆蓋全基因組短鏈非編碼RNA Library對幾株黑色素瘤細(xì)進(jìn)行靶向藥物（Vemurafenib）耐藥篩選。從藥物致死劑量確定,耐藥細(xì)胞建立,到高通量測序鑒別導(dǎo)致耐藥短鏈非編碼RNA,單片段短鏈非編碼RNA驗證,生物信息分析等幾個方面對黑色素瘤耐受Vemurafenib進(jìn)行探索。以期能從RNA調(diào)控層面對黑色素瘤耐藥機制進(jìn)行一些闡述。方法:細(xì)胞培養(yǎng)確定Vemurafenib對幾株黑色素瘤細(xì)胞的致死劑量。同時包裝大量逆轉(zhuǎn)錄病毒,感染大量黑色素瘤細(xì)胞。增加病毒庫中短鏈非編碼RNA多樣性的同時,盡量降低同一個細(xì)胞感染病毒數(shù),便于后續(xù)單片段驗證、分析。通過加入Vemurafenib進(jìn)行多輪壓力篩選,經(jīng)過結(jié)晶紫染色、IC50檢測、遷移實驗、流式細(xì)胞周期、q-PCR等方法確定耐藥細(xì)胞的建立。利用二代高通量測序平臺Illumina Hi Seq對誘導(dǎo)耐藥的短鏈非編碼RNA進(jìn)行鑒別,并且單片段導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行驗證。此外,通過生物信息學(xué)分析和q-PCR對黑色素瘤細(xì)... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：107 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

Vemurafenib對Mel-624胞的致死劑量

Vemurafenib對Mel-888胞的致死劑量

為便于實驗條件的統(tǒng)一性，在以后的篩選中我們統(tǒng)一使用 15 μM 作為第一輪耐藥細(xì)胞篩選的劑量。2.2 耐 Vemurafenib 細(xì)胞篩選含有 Library 的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染目的細(xì)胞后，在 BSD 和 Vemurafenib 的壓力下，經(jīng)過幾輪篩選，我們快速得到高度耐 Vemurafenib 的細(xì)胞（圖 1-5 ）。每一種耐藥細(xì)胞的命名為統(tǒng)一在 Patental 細(xì)胞后加 “v”，代表 Vemurafenib。沒有任何一個 Patental 細(xì)胞能在 25 μM 的 Vemurafenib 條件下存活，但是我們篩選出的耐藥細(xì)胞在 30 μM 的 Vemurafenib 下均有存活。為了比對各組間的定量關(guān)系，我們將每個培養(yǎng)皿結(jié)晶紫染色后的細(xì)胞用 70 %乙醇溶解后進(jìn)行 100 倍稀釋，取 200 μL 放入 96 孔板中進(jìn)行酶標(biāo)儀掃描。結(jié)果顯示，超過 20 μM Vemurafenib 后，Mel-624 和 Mel-888 細(xì)胞吸光度基本檢測不到；而 A375 細(xì)胞的吸光度明顯低于 A375v，圖 1-6 （P < 0.01）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Evaluation of SNPs in miR-196-a2, miR-27a and miR-146a as risk factors of colorectal cancer[J]. Renata Hezova,Alena Kovarikova,Julie Bienertova-Vasku,Milana Sachlova,Martina Redova,Anna Vasku,Marek Svoboda,Lenka Radova,Igor Kiss,Rostislav Vyzula,Ondrej Slaby.  World Journal of Gastroenterology. 2012(22)



本文編號：3492869