目的觀察分化抑制因子Id1/Id3對結(jié)腸癌細(xì)胞“干性”的影響,探討對腸癌干細(xì)胞重要的信號通路Wnt和SHH通路的影響機(jī)制。方法應(yīng)用慢病毒感染系統(tǒng)構(gòu)建Id1/Id3敲減的腸癌HCT116細(xì)胞株和Id1/Id3過表達(dá)的正常腸上皮細(xì)胞株NCM460,以及HCT116Sh-Id1、HCT116Sh-Id3細(xì)胞中過表達(dá)c-Myc的細(xì)胞株。應(yīng)用實時無標(biāo)記細(xì)胞檢測技術(shù)（RTCA）、克隆形成實驗、流式細(xì)胞周期分析檢測細(xì)胞增殖水平;Western blot檢測相關(guān)分子的蛋白表達(dá)情況;體外無血清懸浮培養(yǎng)方法檢測細(xì)胞的成球能力;顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),分析EMT改變;分別用Wnt通路的抑制劑FH535和SHH通路的抑制劑HPI-1處理腸癌HCT116細(xì)胞48h,然后Western blot檢測相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1.HCT116細(xì)胞中的Id1/Id3基因沉默后其增殖活性及克隆形成能力明顯下降（p<0.05）,且增殖相關(guān)分子PCNA、Survivin及周期相關(guān)蛋白cyclinD1、cyclinE蛋白水平也明顯下調(diào);PI3K/AKT通路中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)下調(diào)。相反過表達(dá)Id1/Id3基因... 

【文章來源】：福建醫(yī)科大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

HCT116細(xì)胞和NCM460細(xì)胞中Id1/Id3的表達(dá)A：qPCR檢測NCM460及HCT116細(xì)胞中Id1、Id3的mRNA水平；B：westernblot

18圖 1.2 慢病毒感染靶細(xì)胞效率A：熒光顯微鏡下觀察 HCT116 細(xì)胞和 NCM460 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率（10western blot 檢測對照組與實驗組 HCT116 細(xì)胞、NCM460 細(xì)胞中 Id1/I達(dá)；

3. 敲減 Id1/Id3 的 HCT116 細(xì)胞和過表達(dá) Id1/Id3 NCM460 細(xì)胞的生長曲線的比較經(jīng)慢病毒感染獲得穩(wěn)定敲減 Id1/Id3 的 HCT116 細(xì)胞和過表達(dá) Id1/Id3 的NCM460 細(xì)胞，將其用胰酶消化并用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至 1×105cells/ml 后，使用 RTCA 實時細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞增殖能力，取 4 個時間點繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果顯示，在 48h 后，敲減 Id1/Id3 組與 HCT116-con 組相比細(xì)胞的生長受到了抑制（P＜0.05）（圖 1.3A 和 B 所示），過表達(dá) Id1/Id3 組與 NCM460con 組比細(xì)胞的生長受到了促進(jìn)。說明在腸癌細(xì)胞 HCT116 株敲減 Id1/Id3 可以抑制細(xì)胞的增殖。A B


本文編號：3491328