過量紫外線照射是導致皮膚癌發(fā)生的重要原因,其中的發(fā)病機理一直是生物醫(yī)學研究的重點方向。近年來,對于UV照射引起的基因可變剪接的研究越來越得到重視,因為UV照射應激下表達的基因變異體對于腫瘤的形成有重要促進作用。其中,mdm2基因作為一種致癌基因,在多種腫瘤中表現(xiàn)出高水平表達,同時,在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了mdm2基因的多種變異體,這些變異體的出現(xiàn)對于腫瘤的發(fā)生有重要的促進作用。并且,有研究證明UVB照射可以有效誘導mdm2基因的可變剪接過程,但是具體的調控機制仍然不清楚。剪接因子是一類調控基因可變剪接的重要蛋白,它們可以通過調節(jié)基因的可變剪接過程產生不同的基因變異體,從而導致細胞生理過程的改變。但是剪接因子是否調控UVB照射引起的mdm2可變剪接過程還沒有研究報道。本論文以hnRNP Al和ASF/SF2兩個重要的剪接因子為研究對象,用細胞分子生物學方法檢測了剪接因子hnRNP Al和ASF/SF2在UVB引起的mdm2基因可變剪接過程中的調節(jié)作用。另外,剪接因子hnRNP Al和ASF/SF2在多種類型的腫瘤中都表現(xiàn)出高表達,被認為是一種促進癌癥的因子,研究兩因子對于UVB照射的響應及細胞... 

【文章來源】：重慶大學重慶市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：134 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
主要縮略詞
1 緒論
    1.1 問題的提出和意義
    1.2 國內外研究現(xiàn)狀
        1.2.1 UV照射與基因的可變剪接
        1.2.2 UV照射與細胞信號通路激活
        1.2.3 UV照射與細胞自噬
    1.3 本研究的目的及研究內容
        1.3.1 本研究的目的
        1.3.2 本研究的主要內容
        1.3.3 本研究的創(chuàng)新點
2 UVB引起的mdm2的可變剪接
    2.1 前言
    2.2 實驗儀器、材料與試劑
        2.2.1 實驗儀器
        2.2.2 實驗材料與試劑
    2.3 實驗方法
        2.3.1 細胞培養(yǎng)、凍存及復蘇
        2.3.2 UVB照射
        2.3.3 總RNA的提取及檢測
        2.3.4 RNA反轉錄
        2.3.5 RT-PCR檢測基因表達
        2.3.6 質粒構建(pcDNA3.1 mdm2-FL and mdm2B)
        2.3.7 質粒瞬時轉染
        2.3.8 CCK-8檢測細胞存活率
    2.4 實驗結果
        2.4.1 UVB照射導致了mdm2基因的可變剪接
        2.4.2 pcDNA3.1/mdm2-FL和pcDNA3.1/mdm2 B質粒的構建
        2.4.3 mdm2-FL和mdm2 B對細胞在UVB照射后存活率的影響
    2.5 討論
    2.6 本章小結
3 剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2在UVB引起的mdm2可變剪接過程中的調控作用
    3.1 前言
    3.2 實驗儀器、材料與試劑
        3.2.1 實驗儀器
        3.2.2 材料與試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 UVB照射
        3.3.2 Western blot
        3.3.3 瞬時轉染重組質粒及siRNA
        3.3.4 總RNA提取及檢測
        3.3.5 RNA反轉錄
        3.3.6 RIP-RT-PCR (RNA沉淀Real-time PCR檢測)
    3.4 實驗結果
        3.4.1 UVB照射后HaCaT細胞中剪接因子hnRNPA1和ASF/SF2表達增加
        3.4.2 通過質粒瞬時轉染過表達和用siRNA沉默hnRNP A1和ASF/SF2在HaCaT細胞中的表達
        3.4.3 hnRNP A1和ASF/SF2的表達對于mdm2可變剪接的影響
        3.4.4 hnRNP A1可以調控UVB照射引起的mdm2的可變剪接
    3.5 討論
    3.6 本章小結
4 剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2對UVB劑量和時間的響應以及細胞定位的改變
    4.1 前言
    4.2 實驗儀器、材料與試劑
        4.2.1 實驗儀器
        4.2.2 實驗材料與試劑
    4.3 實驗方法
        4.3.1 UVB照射
        4.3.2 Western blot
        4.3.3 免疫熒光
        4.3.4 細胞質細胞核蛋白分離
        4.3.5 siRNA轉染
        4.3.6 細胞存活率的測定
    4.4 實驗結果
        4.4.1 UVB照射劑量及時間對hnRNP A1與ASF/SF2表達的影響
        4.4.2 免疫熒光檢測UVB照射后hnRNP A1與ASF/SF2的細胞定位
        4.4.3 Western blot檢測UVB照射后hnRNP A1與ASF/SF2在細胞質和細胞核中的表達
        4.4.4 沉默hnRNP A1與ASF/SF2的表達對HaCaT細胞在UVB照射后的細胞存活率的影響
    4.5 討論
    4.6 本章小結
5 ROS、p53以及NF-к B和Akt通路對于剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2表達的影響
    5.1 前言
        5.1.1 ROS,p53與UVB照射
        5.1.2 NF-κB,Akt信號通路與UVB照射
    5.2 實驗儀器、材料與試劑
        5.2.1 實驗儀器
        5.2.2 實驗材料與試劑
    5.3 實驗方法
        5.3.1 細胞培養(yǎng)、凍存及復蘇
        5.3.2 UVB照射
        5.3.3 藥物處理
        5.3.4 pcDNA 6.0/p53質粒轉染H1299細胞
        5.3.5 Western blot
    5.4 實驗結果
        5.4.1 ROS抑制hnRNPA1和ASF/SF2的蛋白表達
        5.4.2 p53抑制hnRNPA1和ASF/SF2的蛋白表達
        5.4.3 NF-κB信號通路與剪接因子的表達
        5.4.4 Akt信號通路與剪接因子的表達
    5.5 討論
    5.6 本章小結
6 剪接因子hnRNP A1、ASF/SF2與UVB引起的細胞自噬
    6.1 前言
        6.1.1 細胞自噬
        6.1.2 慢病毒系統(tǒng)
    6.2 實驗儀器、材料與試劑
        6.2.1 實驗儀器
        6.2.2 實驗材料與試劑
    6.3 實驗方法
        6.3.1 UVB照射
        6.3.2 Western blot
        6.3.3 pcDNA3.1-EGFP-LC3B質粒的構建
        6.3.4 EGFP-LC3B HaCaT穩(wěn)定細胞株的構建
        6.3.5 藥物及饑餓處理
        6.3.6 質粒的瞬時轉染
    6.4 實驗結果
        6.4.1 UVB可以導致細胞自噬的發(fā)生
        6.4.2 LC3B基因的擴增及pcDNA3.1-EGFP-LC3B質粒的構建
        6.4.3 EGFP-LC3B HaCaT穩(wěn)定細胞株的構建
        6.4.4 通過EGFP-LC3B puncta的形成檢測UVB處理導致細胞自噬的發(fā)生
        6.4.5 饑餓和雷帕霉素引起細胞自噬發(fā)生
        6.4.6 hnRNPA1和ASF/SF2對細胞自噬的影響
    6.5 討論
    6.6 本章小結
7 主要結論與未來工作展望
    7.1 主要結論
    7.2 未來工作展望
致謝
參考文獻
附錄 作者在攻讀博士學位期間科研及發(fā)表論文、專利情況



本文編號：3472327