發(fā)布時間：2017-04-29 01:04

  本文關鍵詞：熱休克蛋白gp96 3’UTR作為ceRNA通過miR-642a調控DOHH表達的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：熱休克蛋白gp96 (glycoprotein 96),也稱作GRP94, HSP90b1, TRA-1, ERp99,作為內質網(wǎng)中最主要的蛋白之一,是細胞質熱休克蛋白HSP90的同源蛋白。熱休克蛋白gp96主要功能為作為分子伴侶幫助新生蛋白的折疊和變性蛋白的降解。我們和他人的研究均發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白gp96在肝癌、乳腺癌、骨髓瘤等多種腫瘤高表達,同時已經(jīng)查明熱休克蛋白gp96可以與Wnt共受體LRP6、胰島素樣生長因子、整合素、HER2、uPAR等相互作用,它對于維持這些腫瘤蛋白的穩(wěn)定性和功能發(fā)揮重要調節(jié)作用,然而熱休克蛋白gp96在調節(jié)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用機制仍需進一步深入研究。MicroRNAs (miRNAs)是一類長度約為22個核苷酸而且進化上非常保守的非編碼小RNA。通常情況下,miRNA會與靶mRNA的3'-UTR不完全配對結合從而導致靶基因的翻譯抑制或降解。它參與了發(fā)育、感染、免疫反應和腫瘤轉移等多種生物學過程。近來的研究發(fā)現(xiàn)一些具有相同miRNA應答元件(miRNA response element, MRE)的長鏈非編碼RNA、假基因編碼RNA、環(huán)形RNA(circular RNA,circRNA)以及部分mRNA.甚至病毒mRNA可作為“海綿”吸附、隔離與其相互作用的miRNA,從而抑制：miRNA的功能,進而導致miRNA其它靶基因的表達上調,實現(xiàn)對niRNA靶RNA的豐度或翻譯活性的調控,從而影響細胞的功能。本文首先通過生物信息學技術預測熱休克蛋白gp96 3'UTR上miRNA潛在作用靶點,通過比較分析我們選擇niR-642a進一步研究。利用雙熒光素酶報告基因活性檢測和免疫印跡分析,我們發(fā)現(xiàn)miR-642a可以特異性靶向熱休克蛋白gp96 3'UTR。根據(jù)文獻報道,在前列腺癌細胞中miR-642a可以調控DOHH的表達細胞增殖。為了查明熱休克蛋白gp96 3'UTR對DOHH表達的影響,我們在人肝癌Huh7細胞系中轉染了野生型和miR-642a結合位點突變的gp96 3'UTR的螢光素酶報告基因質粒,并通過實時實時定量PCR、RNA干擾和免疫印跡分析miR-642a和DOHH的mRNA及其蛋白水平。實驗結果發(fā)現(xiàn)在人肝癌Huh7細胞系中過表達野生型gp96 3'UTR顯著下調miR-642a的水平并同時上調miR-642a靶基因DOHH的表達。為進一步探討熱休克蛋白gp96 3'UTR是否通過miR-642a調節(jié)DOHH的表達,我們在人肝癌Huh7細胞系轉染了人工合成miR-642a的反義抑制劑,結果發(fā)現(xiàn)在干擾gp96表達的同時轉染miR-642a抑制劑,gp96則失去對DOHH的調節(jié)作用,說明gp96 3'UTR對DOHH的調控是依賴于miR-642a。同時實驗還發(fā)現(xiàn)DOHH并不影響gp96的表達。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白gp96 3'UTR作為ceRNA正向調控DOHH的表達,這種調控作用依賴于miR-642a、不依賴于gp96的蛋白表達。我們實驗室以及其他人的研究均發(fā)現(xiàn),gp96的mRNA和蛋白表達在乙肝慢性感染顯著中上調,gp96的表達水平與慢性乙肝疾病進展有著十分密切相關,gp96在肝臟腫瘤中的過量表達與腫瘤的惡性程度和不良預后呈現(xiàn)顯著相關性。目前對gp96在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制全部集中在其作為分子伴侶蛋白的功能,并且我們的研究發(fā)現(xiàn)gp96 mRNA的3’UTR作為ceRNA可上調腫瘤基因DOHH的表達,這為深入研究gp96如何參與調節(jié)肝癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了一種新思路,為全面分析gp96促進腫瘤細胞生長的機制以及靶向治療提供理論依據(jù)。
【關鍵詞】：熱休克蛋白gp96 microRNA 脫氧羥腐氨酸羥化酶 競爭性RNA 細胞增殖
【學位授予單位】：安徽大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;R730.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 英文縮寫詞表8-11
• 第一章 引言11-27
• 1 熱休克蛋白gp96的結構與功能11-18
• 1.1 熱休克蛋白簡介11-12
• 1.2 熱休克蛋白gp96概述12-18
• 2 MicroRNA的研究進展18-27
• 2.1 MicroRNA的發(fā)現(xiàn)及簡介18-19
• 2.2 MicroRNA的生物合成19-21
• 2.3 MicroRNAs分子作用機制21-22
• 2.4 MicroRNA的靶點預測22-24
• 2.5 競爭性內源RNA(ceRNA)假說24-27
• 第二章 gp96 3'UTR作為ceRNA通過miR-642a調控DOHH的表達27-57
• 1 實驗材料27-31
• 1.1 細胞系、質粒和菌株27
• 1.2 引物和siRNA27-28
• 1.3 試劑與抗體28
• 1.4 主要儀器28-29
• 1.5 溶液配制29-31
• 2 實驗方法31-47
• 2.1 質粒的構建31-35
• 2.2 質粒的定點突變35-36
• 2.3 細胞傳代、凍存、復蘇和轉染36-38
• 2.4 細胞內總RNA的提取38
• 2.5 RNA的反轉錄38-40
• 2.6 實時定量PCR40-41
• 2.7 Western bolting41-44
• 2.8 雙熒光素酶報告基因檢測44-45
• 2.9 統(tǒng)計學分析45-47
• 3 實驗結果47-55
• 3.1 熱休克蛋白gp96 pcDNA3.1表達載體的構建與鑒定47-48
• 3.2 熱休克蛋白gp96 3'UTR含有miR-642a的靶點48-50
• 3.3 熱休克蛋白gp96 3'UTR上調DOHH的表達50-52
• 3.4 熱休克蛋白gp96通過miR-642a參與調控DOHH的表達52-53
• 3.5 DOHH不影響的熱休克蛋白gp96表達53-55
• 4 討論55-57
• 參考文獻57-67
• 作者簡歷和發(fā)表文章67-69
• 致謝69

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