乳腺癌的高發(fā)病率嚴(yán)重影響我國婦女的身心健康,而早發(fā)現(xiàn)并及時治療可以降低其帶來的死亡率。研究表明,基因啟動子區(qū)域是否存在被甲基化,可以成為早期篩查乳腺癌的重要生物學(xué)指標(biāo)。隨著“液態(tài)活檢”技術(shù)的快速發(fā)展,發(fā)現(xiàn)監(jiān)測游離DNA的甲基化水平對腫瘤的早期診斷具有重要的臨床意義。因此,本文建立了一種一體化評估乳腺癌患者血清樣本中DNA甲基化的方法,為乳腺癌早期診斷提供新思路。1、針對血清樣本,優(yōu)化了一種基于磁珠法的核酸提取試劑盒,包括磁珠用量,核酸助沉劑的量等,并進(jìn)行了一系列性能測試,如試劑盒的穩(wěn)定性測試和回收率測試。結(jié)果顯示,該試劑盒穩(wěn)定性好,其核酸的回收率也在90%以上。同時,其對真實樣本有著相同甚至更優(yōu)于商用柱式法試劑盒的提取效果。最后,實驗還優(yōu)化了該試劑盒的提取步驟,合并了裂解和結(jié)合步驟,大大的縮短了核酸提取時間。2、建立了一種重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增技術(shù)（RAA）熒光檢測SNRPN基因甲基化的新方法。實驗主要包括篩選RAA熒光檢測方法所需的引物與探針,并經(jīng)過一系列優(yōu)化,包括反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度,最終得到了最優(yōu)的體系。然后,通過合成了一段標(biāo)準(zhǔn)的甲基化模板,用于甲基化基因定量曲線的繪制。實驗結(jié)果... 

【文章來源】：湖南工業(yè)大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

磁珠法提取核酸的過程原理圖

碩士學(xué)位論文3在高鹽濃度與低pH值的條件下，溶液中的羥基磁珠會與核酸通過疏水作用、氫鍵作用和靜電作用等發(fā)生特異性結(jié)合，而不與其他雜質(zhì)（如蛋白、糖類）結(jié)合，迅速從生物樣品中捕獲到核酸。而在低鹽濃度和高pH值的條件下，羥基磁珠會與結(jié)合的核酸分離，從而達(dá)到釋放核酸的目的。利用磁珠法提取試劑盒來純化樣本中的核酸，其最大優(yōu)點就是可以自動化。整個提取過程在有磁場條件下磁珠可以發(fā)生定向的聚集或分散，從而可減少需離心等手工操作的使用。磁珠法是也目前應(yīng)用最為廣泛的一種核酸提取方法，其能實現(xiàn)自動化提取核酸，大大提高了工作效率。其提取流程如圖1-1所示：將血清樣本做簡單處理，然后經(jīng)過裂解步驟-結(jié)合步驟-洗脫步驟，最后得到純化后的核酸。表1-1內(nèi)列舉了國內(nèi)外部分磁珠法提取游離DNA試劑盒的產(chǎn)品信息。表1-1磁珠法提取游離DNA試劑盒的產(chǎn)品信息Table1-1Productinformationofmagneticbeadscell-freeDNAextractionkit廠家產(chǎn)品名稱樣本類型樣本體積產(chǎn)率海貍BeaverBeadsCirculatingDNAKit血清、血漿等0.2-5mL85%ThermoFisherMagMAXCell-FreeDNA(cfDNA)Isolation血清、血漿、尿液0.5-10mL10–12ng/mL天根生化MagneticSerum/PlasmaDNAKit血漿、血清等0.4-5mL84%ANGENMagPureCirculatingDNAMaxiKit血漿、血清等2-6mL86%柱式法：圖1-2柱式法提取核酸的過程原理圖Figure1-2Schematicdiagramofnucleicacidextractionbycolumnmethod柱式法是提取游離DNA的高效方法，其可以在較低的樣本體積中獲得較高的DNA產(chǎn)率。目前，柱式法提取試劑盒中的離心柱主要是以硅膠濾膜作為固相載體，然后基于二氧化硅可選擇性結(jié)合核酸的獨特屬性，實現(xiàn)核酸的提取與純化。

DNA甲基化檢測方法的建立及其在乳腺癌血清樣本的應(yīng)用12圖1-3cfMeDIP-seq方法的示意圖Figure1-3SchematicrepresentationofthecfMeDIP–seqprotocol1.4重組酶介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種廣泛用于專業(yè)檢測機(jī)構(gòu)的核酸檢測技術(shù)，但由于這想技術(shù)操作復(fù)雜、所需儀器昂貴、涉及多重變溫過程，所以其并不適用于家庭檢測和基層檢測。因此，為了克服PCR技術(shù)的缺點，等溫擴(kuò)增檢測技術(shù)引起研究者廣泛關(guān)注。近十幾年來，新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，如環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)67、重組酶聚合酶擴(kuò)增68、滾環(huán)擴(kuò)增69、依賴解旋酶DNA恒溫擴(kuò)增技術(shù)70等等，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活的各個方面，并且獲得了一定的實際應(yīng)用價值。目前，一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)-重組酶介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（Recombinase-aidamplification,RAA）技術(shù)被發(fā)展71，并迅速應(yīng)用于病原體檢測、食品成分分析、病毒分析，疾病分析等領(lǐng)域72-75。這種技術(shù)的基本原理是：首先由引物、重組酶、單鏈結(jié)合蛋白形成復(fù)合體，在引物同源的序列處會使雙鏈的靶DNA解旋，接下來單鏈結(jié)合蛋白（SSB）會與解離的單鏈DNA結(jié)合來防止單鏈DNA復(fù)性，最后在dNTP存在的情況下，由DNA聚合酶完成鏈的延伸，該擴(kuò)增過程可在5-20分鐘完成76（如圖1-4所示）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]血清游離DNA濃度及完整性在食管癌診斷中的價值[J]. 邱蘊文,申嫻娟,金春景,曹興建,鞠少卿.  中華腫瘤雜志. 2018 (12)



本文編號：3337428