1.研究背景DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳學修飾（epigenetic modification）在基因轉錄調節(jié)過程起著重要作用,是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中重要的分子事件,是近年來生命科學的熱門研究領域之一,其中DNA甲基化是研究得最為廣泛的表觀遺傳學修飾。DNA甲基化過程為在DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase, DNMT）的作用下,以共價結合的方式給基因組CpG島中胞嘧啶添加甲基基團的過程。正常的基因組甲基化模式（DNA methylation pattern）保證了細胞進行精確的基因轉錄調節(jié),后者對于細胞正常功能的發(fā)揮起至關重要的作用。然而在基因轉錄調節(jié)過程,DNA甲基化并不是唯一起決定性作用的表觀遺傳學修飾,眾多研究已經(jīng)表明,DNA甲基化后的甲基結合蛋白（methyl-CpG binding domain protein, MBD）介導的組蛋白修飾在基因轉錄過程可能發(fā)揮的作用比DNA甲基化更為重要。MeCP2 （methyl-CpG binding protein 2）是MBD家族最重要的成員之一,也是潛在的腫瘤臨床治療靶點。大量研究表明,MeCP2是一個... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學廣東省

【文章頁數(shù)】：113 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖４質粒及其酶切鑒定（１？５運組質粒化ＶＸ－ＭＥＣＰｌ？５酶切電泳，Ｍａｒｋｅｒ：５０００ｂｐｍａｒ］ｃｅｒ）??巧ｇｕｒｅ?４，?Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｅｎｚｍａｔｉｃ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｂｙ?ｅ�。澹悖簦颍铮穑瑁铮椋澹螅椋螅�??

依次１０倍倍比稀釋病毒，即（１〇－３、１０人１〇－５、１〇－６、１０－７），混勻稀釋的病毒，??分別加到４８孔中，每孔１００＾１１，３７°Ｃ，?５％（：０２繼續(xù)培養(yǎng)４８１１。利用巧光倒置顯??微鏡檢測統(tǒng)計各個孔帶巧光細胞的數(shù)量，計算出病毒的滴度。圖５的慢病毒的??滴度約為７．３ｘ１０６。??９．?ＴＫ６細胞ＭＥＣＰ２基因髙表達細胞株的構建??培養(yǎng)ＴＫ６細胞，將約４ｘｌ〇５個ＴＫ６細胞接種于Ｔ２５的細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)??１８?ｈ后，取病毒０．５?ｍＬ并加入ＲＰＭ－１６４０完全培養(yǎng)基，再加入ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ至終??濃度８?＾１３／１１正。去除培養(yǎng)瓶中原有的完全培養(yǎng)基，加入上述含慢病毒的ＲＰＭＩ－１６４０??完全培養(yǎng)基。轉染２４ｈ后去除含慢病毒的ＲＰＭＩ－１６４０完全培養(yǎng)基，加入正常的??ＲＰＭ－１６４０完全培養(yǎng)基再培養(yǎng)２４?ｈ，然后換用１?＾ｌｇ／ｍＬ?Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ對細胞進行篩??選，每隔２?ｄ換液一次，篩選時間為７ｄ。篩選完成后，去除培養(yǎng)瓶中含Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ??的完全培養(yǎng)基，加入正常的完全培養(yǎng)基使細胞正常生長。??（十蘭）裸鼠體外成瘤實驗??ＢＡＬＢ／Ｃ免疫缺陷雌性小鼠從廣東省實驗動物

為初步鑒定其惡性表型，Ｗ細胞計數(shù)法和ＣＣＫ－８試劑盒檢測惡性轉化細??胞的生長速度。細胞計數(shù)法檢測結果顯示，細胞培養(yǎng)７２?ｈ后，ＨＱ惡性轉化細胞??的生長速度是ＰＢＳ正常細胞的３．８５倍（圖７Ａ），差異有統(tǒng)計學意義（戶＜０．０５）。??該結果用ＣＣＫ－８細胞活力檢測試劑盒進一步證實了（圖７Ｂ），差異有統(tǒng)計學意??義（Ｐ＜０．０５）。該結果表明，ＨＱ長時間處理后，細胞生長速度加快，細胞已經(jīng)??巧步具有腫瘤惡性表型。??Ａ?—?Ｂ??Ａ?含?４．Ｓ］?＊?〇?ＺＳ］?＊??０?３．５－?巧?２．０－??ＰＢＳ?ＨＱ?ＰＢＳ?ＨＱ??圖７惡性轉化細胞生長速度檢測??Ｆｉｇｕｒｅ?７．?Ｃｅｌｌ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ａｓｓ巧?ｂｙ?ｃｅｌｌ?ｃｏｕｎｔｉｎｇ?（Ａ）?ｏｒ?ＣＣＫ－８?ｋｉｔ?巧）？?＊?ＶＳ．?ＰＢＳ?尸＜０．０５．??３．惡性轉化細胞細胞周期和細胞調亡改變??細胞周期速度加快是腫瘤細胞的另一生物學性狀。為進一步鑒定其惡性程??度，用＾％乙醇固定細胞，ＷＰＩ標記細胞后，用流式細胞術，檢測惡性轉化細??胞細胞周期分布情況。結果顯示，惡性轉化細胞Ｓ期細胞比例比正常細胞多，??由正常細胞的４１．１％增加到４８．２％?（圖８），差異有統(tǒng)計學意義（戶＜０．０５）。同時使??用ＰＩ和巧ＴＣ的雙標記法流式細胞術對兩種細胞的調亡情況進行了分析，結果??表明，兩種細胞的調亡率沒有明顯差別（圖９），未見統(tǒng)計學差異（戶＞０．０５）。導??致該結果的出現(xiàn)可能是由于沒有對細胞進行調亡誘導所致。使用各種細胞調亡??誘導方法對細胞進行誘導

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Interaction among Rb/p16, Rb/E2F1 and HDAC1 Proteins in Gallbladder Carcinoma[J]. 王欣,黃凱,徐立寧.  Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences）. 2009(06)

碩士論文
[1]pIRES-GFP-hPENK的構建及其鞘內注射的表達[D]. 李永輝.河南科技大學 2010
[2]反式二羥環(huán)氧苯并芘誘導惡變細胞中miR-494和miR-22對PTEN基因調控及其功能研究[D]. 劉林華.廣州醫(yī)學院 2009



本文編號：3333478