發(fā)布時間：2021-07-04 00:53

　　背景:目前已經(jīng)報道了KCTD11在幾種腫瘤類型中是潛在的腫瘤抑制劑。然而,尚未在人類非小細胞肺癌（NSCLC）中報道KCTD11的表達及其作用。其潛在的分子機制是否與其具有Cullin介導(dǎo)的活性的KCTD11 BTB結(jié)構(gòu)域相關(guān)尚不清楚。研究方法:利用免疫組化檢測139例NSCLC患者組織樣本KCTD11的表達情況并分析其與諸多臨床病理因素的相關(guān)性。在體內(nèi)外驗證KCTD11對肺癌細胞生物學(xué)行為的影響。采用Western blot、雙熒光素酶報告基因、RT-qpcr、免疫熒光和核漿蛋白質(zhì)分離觀測Wnt通路和Hippo通路的活性變化及對EMT過程的作用。免疫沉淀、共轉(zhuǎn)染和構(gòu)建剪切體KCTD11-ΔBTB驗證KCTD11對Wnt/β-catenin與Hippo/YAP的潛在作用及KCTD11自身作用位點。結(jié)果:在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)KCTD11在肺癌組織和細胞中低表達,并且與分化程度,腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。KCTD11的低表達與預(yù)后不良有關(guān)。KCTD11的過表達抑制了肺癌細胞的增殖和遷移,在敲除后結(jié)果相反。進一步的研究表明,KCTD11通過抑制β-catenin和YA... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：46 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

KCTD11抑制NSCLC的增殖和侵襲A-C：在過表達KCTD11的A549細胞中，集落形成測定，Transwell測定和MTT測定顯示細胞的增殖和侵襲能力減小

14中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文補充圖S1KCTD11抑制NSCLC細胞的惡性行為A–C：在過表達KCTD11的H460細胞中，集落形成測定，Transwell測定和MTT測定顯示細胞的增殖和侵襲減少。D-F：而集落形成測定，Transwell測定和MTT測定表明，在缺失KCTD11的HBE細胞中，細胞的增殖和侵襲增加。G：在裸鼠中過表達KCTD11并飼養(yǎng)6周后未進行解剖的裸鼠的照片。H：與對照組（n=7）相比，向裸鼠（n=7）的尾靜脈注射穩(wěn)定表達KCTD11的A549細胞（G418篩查）減少了肺轉(zhuǎn)移的病灶數(shù)。縮寫：EV，空向量；NC，負控制。3.3KCTD11通過上調(diào)NSCLC細胞中YAP的磷酸化水平激活了Hippo通路通過雙重?zé)晒馑孛笢y定，轉(zhuǎn)染KCTD11上調(diào)了Hippo信號通路的活性，而敲除KCTD11抑制了Hippo信號通路的活性（圖3A-B）。然后，研究發(fā)現(xiàn)在KCTD11過表達的A549細胞中，與Hippo信號通路相關(guān)的靶基因CTGF，CYR61和cyclinEmRNA被下調(diào)，而在KCTD11敲除的H1299細胞中被上調(diào)（圖3C-D），表明KCTD11參與Hippo信號通路。因此，我們很好奇KCTD11在Hippo通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中是否參與調(diào)節(jié)YAP/P-YAP的表達。在過表達KCTD11的A549細胞和H460細胞系以及缺乏內(nèi)源性KCTD11的H1299和HBE細胞系中，YAP，LATS1均未見明顯變化，但研究發(fā)現(xiàn)P-YAP被KCTD11明顯上調(diào)。當研究中敲除內(nèi)源性KCTD11時，我們觀察到在H1299細胞和HBE細胞中P-YAP被下調(diào)。與增殖相關(guān)的基因CyclinE和CTGF在KCTD11過表達的細胞系被下調(diào)，而在缺乏

15中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文內(nèi)源性KCTD11表達的細胞系被上調(diào)（圖3E-F）。通過細胞核-細胞質(zhì)蛋白分離和免疫熒光，我們還發(fā)現(xiàn)YAP的核轉(zhuǎn)位在轉(zhuǎn)染KCTD11的A549細胞系中受到抑制。圖3G，I）。在H1299細胞系中結(jié)果相反，KCTD11的敲除促進了YAP的核易位（圖3H，J）。因此，這些結(jié)果表明KCTD11通過促進YAP的磷酸化激活了Hippo信號通路。圖3KCTD11通過上調(diào)NSCLC細胞中YAP的磷酸化水平來激活Hippo途徑A-B：KCTD11過表達抑制了TEAD的轉(zhuǎn)錄活性。HippopGTII熒光素酶報告基因測定表明，KCTD11在A549細胞中的過表達上調(diào)了Hippo信號通路的活性，而缺失KCTD11在H1299細胞中則抑制了Hippo信號通路的活性。實驗用對照或wnt3a條件培養(yǎng)基處理6小時。C-D：在過表達KCTD11的A549細胞中下調(diào)了Hippo通路的目標靶基因CTGF，CYR61和CyclinEmRNA表達水平，在缺失KCTD11的H1299細胞中上調(diào)了其目標靶基因的mRNA表達水平。E-F：Western印跡顯示，在過表達KCTD11的A549細胞和H460細胞中，YAP的磷酸化水平增加，并且Hippo途徑的靶基因CTGF和CyclinE的表達水平下調(diào)。在缺失KCTD11的H1299細胞和HBE細胞中，YAP的磷酸化水平降低，CTGF和CyclinE的表達水平上調(diào)，GAPDH用作上樣對照。使用ImageJ軟件分析灰度值。G–J：細胞核-細胞質(zhì)蛋白分離和免疫熒光表明，在轉(zhuǎn)染KCTD11后，A549細胞系中YAP的核轉(zhuǎn)位受到抑制，并且


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