目的本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)miR-146b能引起卵巢癌細胞骨架排列紊亂,抑制卵巢癌侵襲轉移。在此基礎上,本課題以miR-146b的靶基因為切入點,從肌動蛋白骨架和細胞間連接角度解析miR-146b引起卵巢上皮細胞癌（epithelial ovarian cancer,EOC）細胞形態(tài)改變,進而抑制細胞遷移和侵襲的機制。方法1.利用生物信息學方法預測miR-146b的靶基因,將其中評分較高且與維持細胞形態(tài)密切相關的Ras相關的C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1）作為候選靶基因,采用雙熒光素酶報告基因實驗驗證其與miR-146b的靶向關系。2.免疫印跡檢測瞬時或穩(wěn)定過表達miR-146b對Rac1蛋白表達水平的影響。3.構建兩個pLKO.1-puro Rac1 shRNA慢病毒載體,分別包裝后感染卵巢癌細胞,免疫印跡驗證Rac1敲減水平。4.倒置顯微鏡觀察穩(wěn)定敲減Rac1的卵巢癌細胞形態(tài),免疫印跡檢測細胞肌動蛋白和緊密連接蛋白1（zonula occludens-1,ZO-1）的表達水平,免疫熒光染色后采用共聚焦熒... 

【文章來源】：江蘇大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

miRNA的生物合成和效應途徑[28]

miR-146b作用于Rac1調控人卵巢癌細胞遷移和侵襲的機制研究16（14）15%分離膠：ddH2O500μL，30%丙烯酰胺2.5mL，1.5MTris-HCl（pH=8.8）1.9mL，10%SDS50μL，10%APS50μL，最后加TEMED2μL。（15）濃縮膠×2：ddH2O2.1mL、30%丙烯酰胺500μL、1.5MTris-HCl（pH=6.8）380μL、10%SDS30μL、10%APS30μL、最后加TEMED3μL，3.1.5質粒圖譜圖3.1psiCHECKTM-2質粒圖譜[76]Figure3.1PlasmidmapofpsiCHECKTM-2[76]3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)HEK-293T、SKOV3和HO8910均采用含10%FBS和100U/ml青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，置5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)、傳代。3.2.1.1細胞傳代取出生長狀態(tài)良好的細胞，移液槍貼壁棄去廢舊的培養(yǎng)基，用37℃PBS洗滌細胞兩次。均勻滴加剛好能鋪滿培養(yǎng)皿底部的胰酶，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，待細胞變圓時立刻加入等體積的培養(yǎng)基終止消化。用移液槍將貼壁的細胞吹打并轉移至15mL離心管中，800rpm離心5min。棄去上清，用1mL培養(yǎng)基重懸，在培養(yǎng)皿中加入3-4mL培養(yǎng)基，按實驗需求吸取合適的細胞懸液傳代。3.2.1.2細胞凍存將細胞匯合度約90%的細胞同3.2.1.1操作得細胞沉淀，用500μL培養(yǎng)基重懸。按照DMEM:FBS:DMSO=8:9:3的比例制備凍存液，和細胞懸液等比例混合后轉移至凍存管，梯度凍存4℃30min、-20℃120min，最后于-80℃短期保存或液氮長期保存。3.2.2Rac13’UTR熒光報告基因載體的構建

江蘇大學碩士學位論文253.3.1生物信息學預測miR-146b的靶基因用三種生物信息學軟件miRanda、miRDB、miRWalk綜合預測出miR-146b可能的靶基因，從中挑選出與細胞骨架、腫瘤轉移等生物學行為高度相關的基因Rac1，針對其種子序列設計突變序列，見圖3.2。圖3.2miR-146b與Rac1的結合分析及針對種子序列（下劃線）設計的突變序列Figure3.2BioinformaticpredictionofRac1astargetofmiR-146bandputativeseed-pairregionwasinred3.3.2雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-146b靶向Rac1雙熒光素酶報告基因實驗是確定miRNA靶基因的金標準[77]，為了驗證Rac1是miR-146b的靶基因，我們將進行雙熒光素酶報告基因實驗，并采用已報道的miR-146b的靶基因Fbxl10作為陽性參照。3.3.2.1Rac13’UTR熒光報告基因載體及其突變體的鑒定為了滿足雙熒光素酶報告基因的實驗需求，本研究構建了兩個報告基因質粒，一個是在psiCHECKTM-2載體中插入Rac13’-UTR全長序列（1521bp），命名為psiCHECK2-Rac1-3’UTR，另一個是采用重疊PCR法將Rac13’-UTR中與miR-146b結合的種子序列突變后插入psiCHECK2載體中得到的psiCHECK2-Rac1-3’mut載體。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，五個psiCHECK2-Rac1-3’UTR載體的樣本經PCR擴增后可于1521bp處發(fā)現(xiàn)條帶，psiCHECK2-Rac1-3’mut載體經PCR擴增后僅樣本7、9、11于1521bp處可見條帶，見圖3.3。選取PCR鑒定成功的樣本1和7送至公司測序，測序結果證實插入psiCHECKTM-2載體的序列與Rac1-3’UTR或Rac1-3’mut片段一致，說明兩個載體psiCHECK2-Rac1-3’UTR和psiCHECK2-Rac1-3’mut均構建成功。

【參考文獻】：
博士論文
[1]miR-146b在卵巢上皮細胞癌中的作用及機制研究[D]. 閆美娜.江蘇大學 2018



本文編號：3233861