一碳代謝通路中多種代謝酶與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都有密切關(guān)系,它們都可以作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn).絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2（SHMT2）作為其中的關(guān)鍵代謝酶之一,對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長增殖具有非常重要的意義.然而SHMT2參與調(diào)解腫瘤細(xì)胞代謝的具體作用機(jī)制目前尚不明確.本研究發(fā)現(xiàn)SIRT5能去琥珀�；疭HMT2,提升其酶活,并鑒定到第181位賴氨酸是SHMT2的主要琥珀�；稽c(diǎn).同時(shí),本文還發(fā)現(xiàn)高濃度的甲氨蝶呤（MTX）能通過抑制SIRT5的表達(dá),提升SHMT2琥珀�；�,達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的,這也為通過抑制SIRT5阻斷腫瘤生長提供了新的理論支撐. 

【文章來源】：復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2020,59(01)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

SHMT2和SIRT5相互作用

由于SIRT5是去�；揎椕福邆淙ョ牾；ケ；腿ノ於；钚�，且這些蛋白翻譯后修飾的過程是可逆的，煙酰胺（Nicotinamide,NAM）作為SIRT5去�；揎棶a(chǎn)物，能夠反饋抑制去�；揎椀陌l(fā)生，故使用NAM處理細(xì)胞，以確定SHMT2能夠被酰化修飾．通過包裝慢病毒感染HEK293T細(xì)胞，我們構(gòu)建了表達(dá)Flag-SHMT2的穩(wěn)定細(xì)胞系．用500μmol/L NAM處理該穩(wěn)定株后發(fā)現(xiàn)，在8h內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，SHMT2琥珀�；讲粩嗵岣撸；臀於；瘏s無明顯變化趨勢(shì)（圖2(a））．因此，確定SHMT2能夠被琥珀酰化修飾．繼而，我們將Flag-SHMT2和HA-SIRT5共轉(zhuǎn)于HEK293T細(xì)胞中，經(jīng)Western blot驗(yàn)證，SIRT5能去琥珀酰化SHMT2蛋白（圖2(c））．同時(shí)，為了驗(yàn)證SHMT2蛋白的琥珀酰化對(duì)其酶活的影響，我們使用DL-β-苯基絲氨酸作為SHMT2酶活反應(yīng)底物檢測(cè)其酶活，發(fā)現(xiàn)NAM處理會(huì)降低SHMT2酶活性，而SIRT5則能顯著提升其酶活性（圖2(b,d））．這證明了SHMT2的琥珀酰化修飾會(huì)抑制本身的催化活性．

首先，為進(jìn)一步確認(rèn)SHMT2蛋白的主要琥珀酰化位點(diǎn)，我們將這些位點(diǎn)上的賴氨酸K分別突變?yōu)楣劝彼酔（模擬琥珀酰化修飾）和精氨酸R（模擬去琥珀�；揎棧z測(cè)相應(yīng)突變蛋白的琥珀�；揎椝胶兔富睿畬�(shí)驗(yàn)表明：與野生型SHMT2蛋白相比，K181E突變蛋白的琥珀�；郊懊富罹@著降低（圖3(b））．雖然K269E,K302E,K469E等3個(gè)位點(diǎn)的琥珀酰化修飾均有所下調(diào)，但其相應(yīng)酶活卻顯著升高（圖3(b）），所以，綜上，我們初步確定K181位點(diǎn)是SHMT2蛋白的主要琥珀�；稽c(diǎn)．其次通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，SHMT2突變蛋白K181E及K181R的酶活在體外顯著性降低（圖3(c））．同時(shí)，在測(cè)定酶活的反應(yīng)液中分別加入HA-SIRT5或NAM，我們發(fā)現(xiàn)野生型的SHMT2蛋白酶活會(huì)分別顯著性地提升及降低，而K181E和K181R兩個(gè)突變蛋白的酶活卻基本沒有發(fā)生改變（圖3(c）），表明SHMT2的181位點(diǎn)突變之后，其酶活不再受SIRT5和NAM影響，進(jìn)一步證明第181位賴氨酸是SHMT2的主要琥珀�；揎椢稽c(diǎn)．值得注意的是，在加入SIRT5之后K181R酶活顯著降低（圖3(c）），這可能是SHMT2存在其他位點(diǎn)受SIRT5調(diào)控．K181E突變體酶活較低（～0.2），故過表達(dá)SIRT5之后酶活無進(jìn)一步的明顯變化；而K181R酶活較高（～0.5），故對(duì)K181R的影響較大．

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]SIRT5, functions in cellular metabolism with a multiple enzymatic activities[J]. YANG Xin,LIU BoYa,ZHU WeiGuo,LUO JianYuan.  Science China（Life Sciences）. 2015(09)



本文編號(hào)：3232260