目的利用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA-ROR1（Lv-shROR1）建立穩(wěn)定沉默ROR1的肺腺癌細(xì)胞株,并利用該細(xì)胞模型初步研究ROR1調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、凋亡和自噬的分子機(jī)制,為后續(xù)以ROR1為治療靶點(diǎn)的研究奠定基礎(chǔ)。方法首先,使用帶有綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)簽的慢病毒介導(dǎo)shRNA-ROR1感染肺腺癌PC9、PC9erlo和NCI-H1975細(xì)胞株,利用熒光顯微鏡檢測(cè)感染細(xì)胞中GFP的熒光信號(hào)來(lái)衡量慢病毒感染細(xì)胞的情況,并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Lv-shROR1沉默ROR1蛋白的效率;其次,利用有限稀釋法從Lv-shROR1感染的肺腺癌細(xì)胞株中挑選單細(xì)胞克隆,進(jìn)一步利用免疫印跡法、流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR檢測(cè)克隆細(xì)胞株ROR1蛋白和mRNA表達(dá)水平進(jìn)而篩選出一系列穩(wěn)定沉默ROR1的單細(xì)胞克隆,作為后續(xù)功能研究的細(xì)胞模型;最后,選取PC9erlo單細(xì)胞克隆R1進(jìn)行后續(xù)研究,分別利用免疫印跡法檢測(cè)該細(xì)胞株中沉默ROR1后細(xì)胞周期和凋亡分子水平的變化;利用Ray Bio?C-series Human Autophagy Array 1和免疫印跡法檢測(cè)ROR1基因沉默前后自噬分子水平的變化;利用H... 

【文章來(lái)源】：成都中醫(yī)藥大學(xué)四川省

【文章頁(yè)數(shù)】：89 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略詞表
引言
第一部分 構(gòu)建并鑒定穩(wěn)定沉默ROR1的肺腺癌細(xì)胞株
    (一)構(gòu)建穩(wěn)定沉默ROR1的肺腺癌細(xì)胞株
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 細(xì)胞株
            1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
                2.1.1 相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的配制方法
                2.1.2 細(xì)胞復(fù)蘇
                2.1.3 細(xì)胞傳代與細(xì)胞換液
                2.1.4 細(xì)胞凍存
                2.1.5 廢液處理
            2.2 慢病毒介導(dǎo)shRNA-ROR1 感染肺腺癌細(xì)胞株
                2.2.1 細(xì)胞接種
                2.2.2 使用不同感染復(fù)數(shù)(MOI)值的慢病毒感染肺腺癌細(xì)胞株
                2.2.3 熒光顯微鏡檢測(cè)慢病毒感染效率
                2.2.4 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株
            2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Lv-shROR1 對(duì)肺腺癌細(xì)胞株膜蛋白R(shí)OR1 的沉默效率
                2.3.1 細(xì)胞接種
                2.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Lv-shROR1 對(duì)肺腺癌細(xì)胞株細(xì)胞膜ROR1 蛋白的沉默效率
                2.3.3 計(jì)算Lv-shROR1 對(duì)肺腺癌細(xì)胞株細(xì)胞膜ROR1 蛋白的沉默效率
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4 討論與小結(jié)
            4.1 討論
            4.2 小結(jié)
    (二)篩選并鑒定穩(wěn)定沉默ROR1的肺腺癌單細(xì)胞克隆
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 細(xì)胞株
            1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
                2.1.1 相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的配制方法
                2.1.2 細(xì)胞復(fù)蘇
                2.1.3 細(xì)胞傳代及細(xì)胞換液
                2.1.4 細(xì)胞凍存
            2.2 有限稀釋法篩選單細(xì)胞克隆
            2.3 利用免疫印跡法檢測(cè)Lv-shROR1 沉默單細(xì)胞克隆ROR1 總蛋白的水平
                2.3.1 細(xì)胞接種
                2.3.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.3.3 免疫印跡法檢測(cè)Lv-shROR1 沉默單細(xì)胞克隆ROR1 總蛋白的水平
                2.3.4 數(shù)據(jù)分析方法
            2.4 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Lv-shROR1 抑制膜蛋白R(shí)OR1 的表達(dá)水平
                2.4.1 細(xì)胞接種
                2.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Lv-shROR1 抑制膜蛋白R(shí)OR1 的表達(dá)水平
                2.4.3 計(jì)算Lv-shROR1 抑制膜蛋白R(shí)OR1后ROR1 的表達(dá)效率
            2.5 利用RT-PCR檢測(cè)Lv-shROR1 沉默ROR1 m RNA的水平
                2.5.1 細(xì)胞接種
                2.5.2 RT-PCR檢測(cè)Lv-shROR1 沉默ROR1 m RNA的水平
                2.5.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4 討論與小結(jié)
            4.1 討論
            4.2 小結(jié)
第二部分 受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(ROR1)調(diào)控肺腺癌細(xì)胞周期、凋亡和自噬的分子機(jī)制
    (一)ROR1調(diào)控肺腺癌細(xì)胞周期的分子機(jī)制
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 細(xì)胞株
            1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
                2.1.1 相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的配制方法
                2.1.2 細(xì)胞復(fù)蘇
                2.1.3 細(xì)胞傳代及細(xì)胞換液
                2.1.4 細(xì)胞凍存
            2.2 利用免疫印跡法檢測(cè)Lv-shROR1 沉默ROR1 細(xì)胞周期分子水平的變化
                2.2.1 細(xì)胞接種
                2.2.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.2.3 免疫印跡法檢測(cè)ROR1 調(diào)控肺腺癌細(xì)胞周期分子CDK4和Cyclin E1 的表達(dá)
            2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4 討論與小結(jié)
            4.1 討論
            4.2 小結(jié)
    (二)ROR1調(diào)控肺腺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 細(xì)胞株
            1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
                2.1.1 相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的配制方法
                2.1.2 細(xì)胞復(fù)蘇
                2.1.3 細(xì)胞傳代及細(xì)胞換液
                2.1.4 細(xì)胞凍存
            2.2 利用免疫印跡法檢測(cè)Lv-shROR1 沉默ROR1 細(xì)胞凋亡分子水平的變化
                2.2.1 細(xì)胞接種
                2.2.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.2.3 免疫印跡法檢測(cè)ROR1 調(diào)控肺腺癌細(xì)胞凋亡分子Caspase-3、Caspase-7、Bak、Bcl-XL和 Bcl-2 的表達(dá)
            2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4 討論與小結(jié)
            4.1 討論
            4.2 小結(jié)
    (三)ROR1調(diào)控肺腺癌細(xì)胞自噬的分子機(jī)制
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 細(xì)胞株
            1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
                2.1.1 相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的配制方法
                2.1.2 細(xì)胞復(fù)蘇
                2.1.3 細(xì)胞傳代及細(xì)胞換液
                2.1.4 細(xì)胞凍存
            2.2 利用Ray Bio?C-series Human Autopahgy Array1 檢測(cè)ROR1 基因沉默前后肺腺癌細(xì)胞株中自噬分子水平的變化
                2.2.1 細(xì)胞接種
                2.2.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.2.3 利用Ray Bio?C-series Human Autopahgy Array1 檢測(cè)ROR1 基因沉默前后肺腺癌細(xì)胞株中自噬分子水平的變化
                2.2.4 數(shù)據(jù)分析方法
            2.3 利用免疫印跡法進(jìn)一步證明ROR1 基因沉默前后肺腺癌細(xì)胞株中LC3 A/B分子水平的變化
                2.3.1 細(xì)胞接種
                2.3.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.3.3 利用免疫印跡法進(jìn)一步證明ROR1 基因沉默前后肺腺癌細(xì)胞株中LC3 A/B分子水平的變化
                2.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4 討論與小結(jié)
            4.1 討論
            4.2 小結(jié)
    (四)ROR1 介導(dǎo)的Akt/GSK-3α/β/m TOR信號(hào)通路在肺腺癌中發(fā)揮重要的致病作用
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 細(xì)胞株
            1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
                2.1.1 相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的配制方法
                2.1.2 細(xì)胞復(fù)蘇
                2.1.3 細(xì)胞傳代及細(xì)胞換液
                2.1.4 細(xì)胞凍存
            2.2 利用Human Phosphor-kinase Array kit檢測(cè)ROR1 基因沉默前后肺腺癌細(xì)胞株中關(guān)鍵激酶磷酸化水平變化
                2.2.1 細(xì)胞接種
                2.2.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.2.3 利用Human Phospho-kinase Array kit篩選ROR1 基因沉默前后肺腺癌細(xì)胞株中關(guān)鍵激酶磷酸化水平變化
                2.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法
            2.3 利用免疫印跡法進(jìn)一步證明ROR1 介導(dǎo)的Akt/GSK-3α/β/m TOR信號(hào)通路在肺腺癌中發(fā)揮重要致病作用
                2.3.1 細(xì)胞接種
                2.3.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.3.3 免疫印跡法檢測(cè)ROR1 調(diào)控肺腺癌細(xì)胞信號(hào)通路分子Akt、P-Akt、GSK-3α/β、m TOR和 P-m TOR的表達(dá)
                2.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法
            2.4 預(yù)實(shí)驗(yàn):利用免疫印跡法檢測(cè)ROR1 調(diào)控肺腺癌細(xì)胞Akt下游關(guān)鍵糖酵解相關(guān)分子HIF-1α分子的表達(dá)
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4 討論與小結(jié)
            4.1 討論
            4.2 小結(jié)
總結(jié)與展望
文獻(xiàn)綜述 探討肺癌新靶標(biāo)ROR1的作用機(jī)制及其臨床運(yùn)用
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1 在讀期間公開(kāi)發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Progress in image-guided radiotherapy for the treatment of non-small cell lung cancer[J]. Xiao-Cang Ren,Yue-E Liu,Jing Li,Qiang Lin.  World Journal of Radiology. 2019(03)
[2]ROR1對(duì)人肺癌A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響[J]. 王作剛,馮彥,于亮,趙子梁,倪建林,鄒俊卿,黃洋.  腫瘤防治研究. 2018(07)
[3]ROR1激活A(yù)KT/FOXO1信號(hào)介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥[J]. 黃洋,馮彥,于亮,趙子梁,鄒俊卿,倪建林,王作剛.  中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2018(02)
[4]受體酪氨酸激酶樣孤兒受體在腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)展[J]. 王凌菲,王皓.  現(xiàn)代免疫學(xué). 2015(02)



本文編號(hào)：3203183