1.目的利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除4T1細(xì)胞中的整合素αavβ3基因,構(gòu)建穩(wěn)定敲除整合素cxvβ3基因的4T1細(xì)胞株;分析阻斷骨唾液酸蛋白（BSP）與整合素的結(jié)合后乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和粘附能力的變化,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PI3K、AKT、ERK、NF-κB p65和IκBa表達(dá)水平和其磷酸化水平的變化,進(jìn)而探討阻斷整合素表達(dá)抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用。2.方法（1）根據(jù)CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則,分別在整合素αv和β3亞基基因的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)2條sgRNA,構(gòu)建lentiCRISPRv2-sgRNA重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)Stbl3,篩選出重組質(zhì)粒進(jìn)測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)染至HEK293Ft細(xì)胞包裝成慢病毒。（2）慢病毒感染4T1細(xì)胞后用嘌呤霉素加壓篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞,用有限稀釋法分離培養(yǎng)單克隆細(xì)胞。（3）提取單克隆細(xì)胞基因組DNA后對(duì)敲除位點(diǎn)附近的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序,用qRT-PCR檢測(cè)穩(wěn)定敲除細(xì)胞株整合素αv和β3亞基mRNA的表達(dá),Western blot檢測(cè)細(xì)胞株整合素αvβ3蛋白質(zhì)的表達(dá)。（4）用CCK-8檢測(cè)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞增殖活性,用劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell檢測(cè)... 

【文章來(lái)源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：84 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?ｌｅｎｔｉＣＲ丨ＳＰＲｖ２質(zhì)粒結(jié)構(gòu)??

Ｆｉｇｕｒｅ?１?－４?Ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＥＧＦＰ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?２９３Ｆｔ?ｃｅｌｌｓ?（１?ＯＯｘ）??３．４確定嘌呤霉素篩選細(xì)胞的濃度??不同濃度嘌呤霉素作用于正常４Ｔ１細(xì)胞后各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的狀態(tài)如圖１－５所??示，從圖中可看出，ｌＵｇ／ｍｌ的嘌呤霉素對(duì)４Ｔ１細(xì)胞基本沒(méi)有殺傷作用；２ｐｇ／ｍｌ??的嘌呤霉素對(duì)４Ｔ１細(xì)胞有一定的殺傷作用；３ｐｇ／ｍｌ的嘌呤霉素對(duì)４Ｔ１細(xì)胞的殺??傷作用明顯，作用４８ｈ后鏡下只見(jiàn)少數(shù)的細(xì)胞存活，７２ｈ則在鏡下只見(jiàn)極少數(shù)幾??個(gè)細(xì)胞存活；４ｎｇ／ｍ丨的嘌呤霉素作用４８ｈ后鏡下只見(jiàn)極少數(shù)兒個(gè)存活細(xì)胞，而??１９??

??３．３細(xì)胞轉(zhuǎn)染包裝慢病毒結(jié)果??質(zhì)粒轉(zhuǎn)染２９３Ｆｔ細(xì)胞后的效果情況如圖丨－４所示，從圖１￣４陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒??ｐＥＧＦＰ轉(zhuǎn)染２９３Ｆｔ細(xì)胞后產(chǎn)生綠色熒光的情況可知此次轉(zhuǎn)染包裝慢病毒效果可??行，提示包裝出的慢病毒可用于感染目的細(xì)胞。??ｗｍｍ?ｍ??■ｈ?ｍ??１２ｈ?２４ｈ??圖１￣４陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒ｐＥＧＦＰ轉(zhuǎn)染２９３Ｆｔ細(xì)胞后效果情況（ｌＯＯｘ）??Ｆｉｇｕｒｅ?１?－４?Ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＥＧＦＰ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?２９３Ｆｔ?ｃｅｌｌｓ?（１?ＯＯｘ）??３．４確定嘌呤霉素篩選細(xì)胞的濃度??不同濃度嘌呤霉素作用于正常４Ｔ１細(xì)胞后各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的狀態(tài)如圖１－５所??示，從圖中可看出，ｌＵｇ／ｍｌ的嘌呤霉素對(duì)４Ｔ１細(xì)胞基本沒(méi)有殺傷作用；２ｐｇ／ｍｌ??的嘌呤霉素對(duì)４Ｔ１細(xì)胞有一定的殺傷作用；３ｐｇ／ｍｌ的嘌呤霉素對(duì)４Ｔ１細(xì)胞的殺??傷作用明顯，作用４８ｈ后鏡下只見(jiàn)少數(shù)的細(xì)胞存活，７２ｈ則在鏡下只見(jiàn)極少數(shù)幾??個(gè)細(xì)胞存活；４ｎｇ／ｍ丨的嘌呤霉素作用４８ｈ后鏡下只見(jiàn)極少數(shù)兒個(gè)存活細(xì)胞，而??１９??


本文編號(hào)：3122934