背景和目的:肺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一,死亡率無論在中國還是世界范圍內均排惡性腫瘤的第一位,且仍呈上升趨勢。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,大多會表現(xiàn)一系列共有的特征,包括:持續(xù)性的增值信號、逃逸生長抑制因子、抵抗細胞死亡及永生化、激活侵襲轉移和促進血管生成。針對腫瘤的血管生成,目前已經(jīng)開發(fā)有針對VEGF及其受體的單克隆抗體還有帕唑帕尼等受體酪氨酸激酶抑制劑等。臨床前研究確認帕唑帕尼等酪氨酸酶抑制劑具有明確的抑制腫瘤增殖、內皮細胞成管和抑制移植瘤增殖的作用,但臨床研究發(fā)現(xiàn)其總體生存期等指標較對照組提升不明顯,尚需對帕唑帕尼等抑制劑的作用機制和細胞耐受反應進行深入的研究。方法:（1）本研究選擇多種非小細胞肺癌細胞系A549、H460、L9981和YTMLC-90作為實驗對象。（2）應用MTT法探究帕唑帕尼對個細胞株合適的干預劑量范圍和時間。（3）利用流式細胞術、劃痕實驗、transwell侵襲實驗探究帕唑帕尼對肺癌細胞周期分布、遷移及侵襲能力的影響。（4）提取10μM帕唑帕尼干預組和溶劑對照組帕唑帕尼的總RNA進行表達譜和miRNA譜的芯片檢測,篩選出各細胞株之間變化趨勢相同的差異表達... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：163 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
縮略語/符號說明
前言
    研究現(xiàn)狀、成果
    研究目的、方法
一、帕唑帕尼對肺癌增殖和轉移能力的體外研究
    1.1 實驗材料
        1.1.1 細胞株
        1.1.2 主要試劑和材料
        1.1.3 主要儀器
        1.1.4 試劑配制
    1.2 實驗方法
        1.2.1 細胞培養(yǎng)
        1.2.2 MTT檢測帕唑帕尼對A549,H460,L9981和YTMLC-90的抑制作用。
        1.2.3 細胞生長曲線的測定
        1.2.4 細胞周期的測定
        1.2.5 細胞遷移能力檢測
        1.2.6 Transwell侵襲實驗
    1.3 結果
        1.3.1 A549、H460、L9981和YTMLC-90生長曲線和倍增時間
        1.3.2 藥物抑制率
        1.3.3 pazopanib對周期的影響
        1.3.4 pazopanib對細胞遷移能力的影響
        1.3.5 pazopanib對細胞侵襲能力的影響
    1.4 討論
        1.4.1 帕唑帕尼的理化性質
        1.4.2 帕唑帕尼對各細胞株存活率的抑制實驗
        1.4.3 帕唑帕尼對細胞遷移能力的影響
        1.4.4 帕唑帕尼對侵襲能力的影響
        1.4.5 帕唑帕尼對非小細胞肺癌周期的影響
    1.5 小結
二、帕唑帕尼作用于多種非小細胞肺癌的表達譜和miRNA譜改變的檢測和驗證
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞株
        2.1.2 主要試劑盒材料
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 試劑配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細胞收集和總RNA制備
        2.2.2 RNA定量和質檢
        2.2.3 芯片雜交
        2.2.4 芯片洗滌
        2.2.5 芯片掃描及數(shù)據(jù)采集
        2.2.6 芯片數(shù)據(jù)處理和分析
        2.2.7 實時定量引物設計
        2.2.8 RealtimePCR
    2.3 實驗結果
        2.3.1 用于miRNA芯片的RNA質檢
        2.3.2 miRNA芯片結果
        2.3.3 差異表達miRNA-mRNA關系及網(wǎng)絡圖
        2.3.4 差異表達基因的realtimePCR驗證
        2.3.5 差異表達miRNA的realtimePCR驗證
    2.4 討論
    2.5 結論
三、糖代謝相關基因PCK2的驗證和功能的初步研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞株
        3.1.2 主要試劑和材料
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 試劑配置
    3.2 實驗方法
        3.2.1 PCK2過表達載體的構建
        3.2.2 RNAoligo序列和訂購
        3.2.3 質粒及oligo轉染
        3.2.4 RealtimePCR檢測PCK2siRNAs干擾效率
        3.2.5 WesternBlot檢測PCK2過表達載體及PCK2siRNAs在蛋白水平對PCK2表達的影響
        3.2.6 轉染PCK2siRNAs及過表達質粒對細胞增殖的影響
        3.2.7 PCK2基因對細胞周期水平的影響
        3.2.8 PCK2基因對低糖高乳酸環(huán)境下細胞葡萄糖消耗及乳酸生成水平的影響
    3.3 實驗結果
        3.3.1 realtimePCR驗證PCK2siRNA干擾效果,探究miR-1233-5p、miR-1307-5p與其的關系
        3.3.2 WesternBlot檢測帕唑帕尼對PCK2的誘導作用,及驗證PCK2-pEGFP過表達效果
        3.3.3 轉染PCK2siRNAs及過表達質粒對周期的影響。
        3.3.4 轉染PCK2siRNAs或帕唑帕尼干預對A549在條件培養(yǎng)環(huán)境下葡萄糖的消耗和乳酸生成的影響
        3.3.5 轉染PCK2siRNAs及過表達質粒對細胞增殖的影響
        3.3.6 轉染PCK2過表達質粒對帕唑帕尼藥物抑制率的影響
    3.4 討論
        3.4.1 改變PCK2表達水平對培養(yǎng)環(huán)境中乳酸和葡萄糖的影響
        3.4.2 改變PCK2表達水平對細胞增殖能力的影響
        3.4.3 改變PCK2表達水平對帕唑帕尼對A549抑制能力的影響
    3.5 小結
四、PTEN對多種抗腫瘤藥物的單藥和聯(lián)合作用的影響
    4.1 實驗材料
        4.1.1 細胞株
        4.1.2 主要試劑和材料
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 主要試劑配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 接種細胞
        4.2.2 稀釋藥物
        4.2.3 加5mg/mlMTT溶液并酶標儀上機檢測
        4.2.4 計算細胞抑制率和聯(lián)合干預的相關參數(shù)
    4.3 結果
        4.3.1 單藥作用48小時對成組細胞株：MEFWT、MEFPTEN-/-,HCT116WT、HCTPTENKO35細胞的抑制作用
        4.3.2 雙藥物聯(lián)合對作用48小時對成組細胞株：MEFWT、MEFPTEN-/-,HCT116WT、HCT116PTENKO35細胞的抑制作用
    4.4 討論
    4.5 小結
全文結論
論文創(chuàng)新點
發(fā)表論文和參加科研情況說明
附錄
參考文獻
綜述
    Reference
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]MiR-192靶向負調控Bim表達誘導肺癌順鉑耐藥[J]. 張芳,李洋,吳蘅,齊康,尤嘉琮,李雪冰,祖玲玲,潘振華,王玉麗,李永文,李穎,王珉,沈旺,周清華.  中國肺癌雜志. 2014(05)
[2]肺癌細胞侵襲過程中蛋白分解酶的作用[J]. 沈曉鳴,黃煒,黃濟群.  廣東醫(yī)學院學報. 2001(02)



本文編號：3033754