高危型人乳頭瘤病毒（High-risk Humanpapillomavirus,HR-HPVs）的感染（如HPV16）是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的必要條件,E6和E7是其主要的致癌基因。HPV16可通過表觀遺傳學(xué)路徑導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,其中研究最多的是DNA甲基化。我們設(shè)想HPV16E6/E7可以通過DNA甲基化修飾導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。本研究將HPV16 E6/E7通過慢病毒感染的方式轉(zhuǎn)入原代人包皮角質(zhì)形成細(xì)胞（Human Foreskin Keratinocytes,HFKs）構(gòu)建永生化細(xì)胞系并進(jìn)行鑒定;觀察將HPV16E6/E7轉(zhuǎn)入原代細(xì)胞及分別沉默腫瘤細(xì)胞中HPV16E6或E7后,DNMTs的表達(dá)情況,目的基因的甲基化水平及表達(dá)情況;最后,將永生化細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞（SiHa、CaSki）進(jìn)行全基因組DNA序列、全基因組RNA及DNA甲基化測序,通過數(shù)據(jù)分析,篩選并發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞永生化及腫瘤細(xì)胞形成過程中發(fā)揮不同功能的目的基因,為進(jìn)一步研究基因的功能奠定基礎(chǔ)。第一部分永生化角質(zhì)形成細(xì)胞的構(gòu)建與鑒定目的:將HPV16E6/E7轉(zhuǎn)入原代HFKs,構(gòu)建永生化細(xì)胞,并對永生化HFKs進(jìn)行鑒定。方法:（1）... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：137 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１．１．３不同代數(shù)ＨＦＫｓ的形態(tài)??

表真皮分離?放入胰酶－ＥＤＴＡ?培養(yǎng)基過２００目篩網(wǎng)?離心管底可見沉淀??圖１．１．２原代ＨＦＫｓ的分離－２??３．２通過體外無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)法，成功獲得原代ＨＦＫｓ，并可傳代、凍存、復(fù)蘇。??在不含血清的ＨＦＫｓ培養(yǎng)基（５００ｍＬＥｐｉＬｉｆｅ培養(yǎng)基＋?５ｍＬＨＫＧＳ）中，３天左右可??見數(shù)個ＨＦＫｓ形成的小集落，７天左右細(xì)胞匯合成片。第１代ＨＦＫｓ生長旺盛，輪??廓清楚，折光性好，形態(tài)呈扁平不規(guī)則多邊形，狀似鋪路石，核為卵圓形（圖１．１．３??Ａ、Ｂ）。連續(xù)傳代１０次左右，細(xì)胞出現(xiàn)衰老表現(xiàn)：擴(kuò)增速度減慢，體積增大，失去??原來形態(tài)，出現(xiàn)膜化現(xiàn)象（圖１．１．３?Ｃ）。??

新鮮包皮組織?去除皮下脂肪組織?剪成ｌｃｍｘｌｃｍ大小?放入Ｄｉｓｐａｓｅｌｌ??圖１．１．１原代ＨＦＫｓ的分離－１??ＫＵＥｕ??表真皮分離?放入胰酶－ＥＤＴＡ?培養(yǎng)基過２００目篩網(wǎng)?離心管底可見沉淀??圖１．１．２原代ＨＦＫｓ的分離－２??３．２通過體外無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)法，成功獲得原代ＨＦＫｓ，并可傳代、凍存、復(fù)蘇。??在不含血清的ＨＦＫｓ培養(yǎng)基（５００ｍＬＥｐｉＬｉｆｅ培養(yǎng)基＋?５ｍＬＨＫＧＳ）中，３天左右可??見數(shù)個ＨＦＫｓ形成的小集落，７天左右細(xì)胞匯合成片。第１代ＨＦＫｓ生長旺盛，輪??廓清楚，折光性好，形態(tài)呈扁平不規(guī)則多邊形，狀似鋪路石，核為卵圓形（圖１．１．３??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：2904012