第一部分臨床水平研究HMGB1/RAGE與自噬在腎癌組織中的表達(dá)【目的】通過(guò)檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌的臨床樣本,分析HMGB1/RAGE和自噬相關(guān)標(biāo)記物(LC3、Beclin-1、PIK3),明確腎癌組織中HMGB1/RAGE的表達(dá)和自噬是否具有相關(guān)性,臨床水平研究腎癌中HMGB1/RAGE和自噬的表達(dá)情況。【方法】Western-Blot、qRT-PCR和免疫熒光法檢測(cè)12例腎透明細(xì)胞癌和相應(yīng)癌旁組織的HMGB1/RAGE和自噬相關(guān)標(biāo)記物(LC3、Beclin-1、PIK3)的表達(dá)情況�！窘Y(jié)果】1.Western-Blot見(jiàn)腎透明細(xì)胞癌中HMGB1蛋白表達(dá)水平(0.6138±0.0691)明顯高于癌旁腎組織表達(dá)水平(0.2247±0.0512)(P0.001);RAGE蛋白表達(dá)水平(0.5467±0.0368)明顯高于癌旁腎組織表達(dá)水平(0.2803±0.0415)(P0.001);LC3蛋白表達(dá)水平(0.4994±0.0674)明顯高于癌旁腎組織表達(dá)水平(0.1293±0.0213)(P0.001);Belcin-1蛋白表達(dá)水平(0.5370±0.0608)明顯高于癌旁腎組織表達(dá)水平(0.1556±0.0359)(P0.001);PIK3蛋白表達(dá)水平(0.4189±0.0570)較癌旁腎組織表達(dá)水平(0.2427±0.0463)有升高趨勢(shì)(P=0.025)。2.qRT-PCR見(jiàn)腎透明細(xì)胞癌中HMGB1 m RNA表達(dá)水平(1.1978±0.2311)較癌旁腎組織表達(dá)水平(0.8093±0.2531)有增高趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.098);RAGE m RNA表達(dá)水平(1.7319±0.2784)明顯高于癌旁腎組織表達(dá)水平(0.8759±0.2043)(P=0.002);LC3 m RNA表達(dá)水平(1.5504±0.1878)明顯高于癌旁腎組織表達(dá)水平(0.7423±0.1126)(P=0.004);Belcin-1 m RNA表達(dá)水平(1.4572±0.1757)明顯高于癌旁腎組織表達(dá)水平(0.6501±0.0530)(P=0.001);PIK3 m RNA表達(dá)水平(1.2629±0.1539)明顯高于癌旁腎組織表達(dá)水平(0.7201±0.0804)(P=0.001)。3.免疫熒光見(jiàn)腎透明細(xì)胞癌中HMGB1/RAGE和自噬蛋白LC3、Beclin-1、PIK3的表達(dá)較癌旁正常組織明顯增強(qiáng)�！窘Y(jié)論】腎透明細(xì)胞癌組織中HMGB1/RAGE和自噬(LC3,Beclin-1,PIK3)均較癌旁組織明顯升高。HMGB1/RAGE和自噬可能在腎腫瘤中發(fā)揮重要作用,對(duì)腎癌的發(fā)生發(fā)展具有臨床意義。第二部分細(xì)胞水平研究HMGB1/RAGE對(duì)腎癌細(xì)胞自噬、凋亡、遷移、增殖和血管生成的影響【目的】通過(guò)檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌的臨床樣本,Western-Blot和qRT-PCR方法檢測(cè)12例腎透明細(xì)胞癌和相應(yīng)癌旁組織的HMGB1/RAGE和自噬相關(guān)標(biāo)記物(LC3、Beclin-1、PIK3)的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)腎癌組織中HMGB1、RAGE和LC3、Beclin-1、PIK3較癌旁組織中均有明顯升高,初步印證HMGB1/RAGE和自噬可能對(duì)腎癌的發(fā)生發(fā)展具有臨床意義。本部分研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),高表達(dá)HMGB1,si RNA沉默HMGB1,可溶性RAGE(s RAGE)阻斷HMGB1和RAGE的結(jié)合,細(xì)胞水平證實(shí)HMGB1通過(guò)結(jié)合RAGE,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,降低凋亡水平,促進(jìn)腎癌細(xì)胞血管生成、增殖以及遷移�！痉椒ā窟x用人腎癌細(xì)胞株A489、ACHN作為研究對(duì)象,分別利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)高表達(dá)HMGB1,si RNA干擾技術(shù)沉默HMGB1,s RAGE阻斷HMGB1和RAGE的結(jié)合,缺氧環(huán)境下培養(yǎng)72h后,采用qRT-PCR、Western blot和免疫熒光檢測(cè)自噬相關(guān)標(biāo)記物(LC3、Beclin-1)、HMGB1和RAGE,流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8檢測(cè)細(xì)胞凋亡、增殖變化,Transwell小室檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移情況。腎癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng),分別高表達(dá)HMGB1、沉默HMGB1,s RAGE阻斷HMGB1和RAGE的結(jié)合,采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)VEGF和VEGFR-2反應(yīng)血管生成的基因和蛋白表達(dá)變化�！窘Y(jié)果】1.對(duì)HMGB1表達(dá)進(jìn)行抑制,可使腎癌細(xì)胞的活性和遷移能力減弱,加快腫瘤細(xì)胞的凋亡速度。通過(guò)CCK8和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡情況,發(fā)現(xiàn)HMGB1的干擾、過(guò)表達(dá)和s RAGE對(duì)A498和ACHN細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡有影響。HMGB1-si RNA轉(zhuǎn)染組和s RAGE處理組腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制,細(xì)胞凋亡明顯增加。Transwell檢測(cè)各組A49和ACHN細(xì)胞的遷移能力發(fā)現(xiàn),與si RNA轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比,HMGB1-si RNA轉(zhuǎn)染組和s RAGE處理組細(xì)胞遷移能力降低,HMGB1過(guò)表達(dá)載體組細(xì)胞細(xì)胞遷移能力上調(diào)。2.HMGB1的干擾、過(guò)表達(dá)和s RAGE影響A498和ACHN細(xì)胞中LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1蛋白的表達(dá)。采用Western blot和qRT-PCR檢測(cè)A498和ACHN各組細(xì)胞中LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1的m RNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)與si RNA轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比,HMGB1-si RNA轉(zhuǎn)染組LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1蛋白的表達(dá)量顯著降低;與空載載體對(duì)照組相比,HMGB1過(guò)表達(dá)載體組LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào);與s RAGE處理組相比,HMGB1-Vec+s RAGE組LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)。3.HMGB1的干擾和s RAGE的處理抑制A498和ACHN細(xì)胞共培養(yǎng)后HUVEC細(xì)胞中VEGF和VEGFR2 m RNA的表達(dá),HMGB1的過(guò)表達(dá)促進(jìn)A498和ACHN細(xì)胞共培養(yǎng)后HUVEC細(xì)胞中VEGF和VEGFR2 m RNA的表達(dá)。提示HMGB1的抑制可下調(diào)VEGF和VEGFR2表達(dá),為腎癌介入治療的目標(biāo)提供了未來(lái)方向�！窘Y(jié)論】質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達(dá)HMGB1、si RNA干擾沉默HMGB以及s RAGE阻斷HMGB1和RAGE的結(jié)合,可影響腎癌細(xì)胞存活率、凋亡、侵襲、自噬和血管生成能力。HMGB1結(jié)合RAGE可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,降低細(xì)胞凋亡,促進(jìn)血管生成,增強(qiáng)腎癌細(xì)胞的增殖、遷移能力。HMGB1可能是一個(gè)潛在的腎癌診斷和治療的靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.11
【部分圖文】：

第一部分臨床水平研究HMGB1/RAGE與細(xì)胞自噬在腎癌組織中表達(dá)及兩者相關(guān)性研究背景我們前期分析了 RCC 患者的腫瘤標(biāo)本，發(fā)現(xiàn) RAGE 在腫瘤組織中明顯高達(dá)，尤其在腫瘤血管周圍明顯增多，并與腫瘤的大小、分期具有一定相關(guān)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的 RAGE mRNA 明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移者。隨訪研究中發(fā)現(xiàn) RAGE 的達(dá)同患者的 5 年生存率呈負(fù)相關(guān)。RAGE 與 RCC 具有的臨床相關(guān)性提示我們RAGE 可能在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，但是其作用機(jī)制尚明了。

圖2：RAGE在RCC中的表達(dá)與患者生存期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。A：遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的RAGE mRNA明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移者；B：RAGE的表達(dá)與生存率呈負(fù)相關(guān)；C:RAGE的表達(dá)與無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移生存率呈負(fù)相關(guān)前期實(shí)驗(yàn)中另外發(fā)現(xiàn)，RAGE在RCC中的表達(dá)與腫瘤微血管密度MVD、VEGF-2正相關(guān)。我們從基因和蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RAGE表達(dá)越高的腫瘤組織中VEGFR-2 mRNA的表達(dá)越多，具有明顯正相關(guān)性，VEGFR-2蛋白的水平也有明顯的升高趨勢(shì)。

圖2：RAGE在RCC中的表達(dá)與患者生存期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。A：遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的RAGE mRNA明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移者；B：RAGE的表達(dá)與生存率呈負(fù)相關(guān)；C:RAGE的表達(dá)與無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移生存率呈負(fù)相關(guān)前期實(shí)驗(yàn)中另外發(fā)現(xiàn)，RAGE在RCC中的表達(dá)與腫瘤微血管密度MVD、VEGF-2正相關(guān)。我們從基因和蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RAGE表達(dá)越高的腫瘤組織中VEGFR-2 mRNA的表達(dá)越多，具有明顯正相關(guān)性，VEGFR-2蛋白的水平也有明顯的升高趨勢(shì)。
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本文編號(hào)：2890706