發(fā)布時(shí)間：2020-11-01 14:06

　　 結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是發(fā)生在人體下消化道的一種癌癥,包括結(jié)腸癌和直腸癌。CRC的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)高居不下,居癌癥發(fā)病率的第三位。在我國,隨著生活水平的提高以及生活習(xí)慣的西化,結(jié)直腸癌的發(fā)病率也在逐年遞增。傳統(tǒng)的手術(shù)治療輔以化學(xué)藥物治療和放射線治療,對(duì)患者的毒副作用大,雖然提高了五年生存率,但是嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量;靶向治療的方法存在天然或獲得性耐藥;免疫治療可能會(huì)并含某些不可預(yù)知的并發(fā)癥;而基因治療存在導(dǎo)入率低、成本高等問題,所以尋找一種安全可靠毒副作用小的治療方式成為主要研究方向。益生菌是一類寄居在人體腸道和生殖系統(tǒng)內(nèi)的活的微生物,對(duì)人體健康有益。乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是益生菌的主要成員,且在近年研究中發(fā)現(xiàn)乳酸菌不僅具有改善物質(zhì)風(fēng)味,天然防腐抑菌等功能,還能維持宿主體內(nèi)的微生態(tài)平衡,保護(hù)宿主腸道健康;刺激宿主免疫,預(yù)防宿主癌癥的發(fā)生。所以使用益生菌進(jìn)行預(yù)防或輔助治療CRC可能正是我們所尋求的安全可靠毒副作用小的治療方式之一。本研究主要從云南傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到的乳酸菌,并挑選10株菌進(jìn)行抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29增殖功能的篩選。益生菌的代謝產(chǎn)物(即發(fā)酵上清)制成凍干粉溶液后,用于處理HT-29細(xì)胞,并用MTT的方法檢測細(xì)胞活力,計(jì)算細(xì)胞存活率,用于評(píng)估乳酸菌的抗增殖能力,最后篩選出兩株具有良好抑制效果的菌株。使用其它結(jié)直腸癌細(xì)胞系對(duì)這兩株菌進(jìn)一步篩選;篩選出來的乳酸菌處理HT-29細(xì)胞后,使用流式細(xì)胞儀檢測處理后細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡情況,最后挑選出一株抗增殖效果最好的乳酸菌,并對(duì)其抗HT-29細(xì)胞增殖的機(jī)理進(jìn)行深入研究。轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法從分子水平上能夠了解HT-29細(xì)胞基因表達(dá)的整體情況,并預(yù)測其抗增殖作用的分子機(jī)理。主要研究內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.從實(shí)驗(yàn)室自主分離保存的菌種中挑選10株用于實(shí)驗(yàn),分別是Lactobacillus fermentum JSL8-2(發(fā)酵乳桿菌JSL8-2)、Pediococcus pentosus 2-4L(戊糖片球菌2-4L)、Lactobacillus plantarum AY01、QB3-1、QB3-3、YM4-3(植物乳桿菌AY01、QB3-1、QB3-3、YM4-3)、Lactococcus latics BZ06(乳酸乳球菌BZ06)、Lactobacillus casei AS02(干酪乳桿菌AS02)、Lactobacillus brevis 3M(短乳桿菌3M)、Lactobacillus curvatus 6M(彎曲乳桿菌6M),乳酸菌的發(fā)酵上清制成凍干粉,使用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸成溶液后,稀釋成不同濃度處理HT-29細(xì)胞,MTT方法檢測細(xì)胞活力,最后篩選出兩株具有良好抗增殖效果的菌株AY01和JSL8-2。2.不同濃度的AY01和JSL8-2處理HT-29細(xì)胞后,結(jié)果顯示,隨著凍干粉溶液濃度的增加,菌株的抗增殖效果越好,且在64 mg/mL和128 mg/mL的濃度下,抑制效果最好。此外,隨著處理時(shí)間的增加,抗增殖效果也越好,且在48 h和60 h時(shí)抑制效果達(dá)到最佳,但在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,抑制效果沒有明顯差異3.分別用不同濃度的AY01和JSL8-2的凍干粉溶液處理CRC細(xì)胞株Caco-2、HCT116、SW620,用MTT法檢測細(xì)胞活力,AY01和JSL8-2對(duì)其它CRC細(xì)胞株也具有抗增殖的作用,且在濃度為64 mg/mL和128 mg/mL時(shí)效果最好,培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到48 h和60 h時(shí)抑制效果也最好。4.使用流式細(xì)胞儀檢測AY01和JSL8-2處理HT-29細(xì)胞后的細(xì)胞周期和凋亡情況,從細(xì)胞水平上評(píng)估這兩株菌的抗增殖能力。研究發(fā)現(xiàn),AY01和JSL8-2都是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)抗增殖作用的,而不是通過阻滯細(xì)胞周期;此外,我們發(fā)現(xiàn),AY01的誘導(dǎo)凋亡能力較JSL8-2的更強(qiáng),所以最終選定的菌株為AY01。5.根據(jù)流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果,32 mg/mL的AY01凍干粉溶液處理HT-29細(xì)胞,使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方式探究細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)情況,結(jié)果顯示,與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因表達(dá)差異較大,正好與流式細(xì)胞儀的結(jié)果相一致。6.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示,AY01作用于HT-29細(xì)胞,主要是通過兩條信號(hào)通路,TGF-β/smad信號(hào)通路和Ferroptosis死亡途徑,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期的阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬以及Ferroptosis死亡。
【學(xué)位單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.34
【部分圖文】：

圖 1 CRC 發(fā)生及發(fā)展示意圖.2.1 CRC 的發(fā)生與腸道微生物腸道微生物是指集聚人體或動(dòng)物體結(jié)腸、直腸等下消化道內(nèi)的微生物。人類的腸道中集著大量的微生物，占人體總微生物量的 78%，其數(shù)量高達(dá) 1014cfu，大約是人體真核細(xì)的 10 倍。隨著科學(xué)研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)腸道微生物在人類健康方面發(fā)揮著重要用，尤以腸道相關(guān)疾病最甚，包括炎癥性腸�。↖nflammatory Bowel Disease, IBD）、潰瘍結(jié)腸炎（Ulcreative colitis, UC）、CRC 等等。近年，許多研究均證實(shí)，與對(duì)照相比，CRC 患者的腸道群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其中與RC 發(fā)生相關(guān)的促炎機(jī)會(huì)致病菌顯著增多，如具核梭桿菌屬、腸球菌科和彎曲桿菌屬等[7, 8]。于此，Tjalsma 等[9]提出腸道菌群致癌的“Driver-Passenger”模型：某些特定的腸道固有菌過誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞染色體不穩(wěn)定、免疫炎癥反應(yīng)參與腫瘤的早期形成，這些腸道固有細(xì)被定義為 “drivers” 菌；其次，癌變過程介導(dǎo)了腸道微環(huán)境的改變，drivers 菌慢慢被其

圖 2 CRC 細(xì)胞凋亡機(jī)制.3 飲食、生活習(xí)慣等因素導(dǎo)致 CRC 的發(fā)生結(jié)直腸癌的發(fā)生很大程度上還受食物和營養(yǎng)因素的影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，30%～50%的結(jié)直癌患者有不當(dāng)膳食結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)因素[17]。研究認(rèn)為，高熱量、高飽和脂肪酸和高膽固醇膳，以及食用富含亞硝胺的食品可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，而高膳食纖維、高維生素、葉酸膳食可能是結(jié)直腸癌的保護(hù)因素[18]。除了飲食，以下風(fēng)險(xiǎn)因素（其中經(jīng)常共同發(fā)生交互）已經(jīng)被識(shí)別和建立在流行病學(xué)上的研究：家族史的結(jié)腸直腸癌，炎癥性腸病，吸，過度飲酒，肥胖和糖尿�。ū� 2）[19]。表 2 結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)與預(yù)防因素的概述[19]因素 風(fēng)險(xiǎn)社會(huì)人口因素年齡 ↑↑↑

圖 2.2 5-FU 對(duì) HT-29 細(xì)胞生長的抑制作用（48 h）同濃度下的凍干粉溶液對(duì) HT-29 細(xì)胞的影響10株菌同時(shí)進(jìn)行篩選，采用從高濃度到低濃度的凍干粉溶液對(duì) HT-29細(xì)胞生長曲線。本實(shí)驗(yàn)的使用濃度依次為 250 mg/ mL、125 mg/ mL、10 mg/ mL、5L，在 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h 處測定 OD 值，用 O
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 宋美璇;李顯蓉;;結(jié)直腸癌的發(fā)生與飲食構(gòu)成因素關(guān)系的研究進(jìn)展[J];中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志;2015年09期

2 祁云霞;劉永斌;榮威恒;;轉(zhuǎn)錄組研究新技術(shù):RNA-Seq及其應(yīng)用[J];遺傳;2011年11期

3 李衛(wèi)芬;文靜;吳紅照;翟玲;余東游;;枯草芽孢桿菌對(duì)肉雞生長性能和腸黏膜抗氧化及免疫功能的影響[J];中國畜牧雜志;2011年09期

4 張紀(jì)偉;杜鵬;陳大偉;崔龍;應(yīng)春妹;;補(bǔ)充雙歧三聯(lián)活菌對(duì)結(jié)直腸癌術(shù)后患者免疫狀況和炎性反應(yīng)的影響[J];中華胃腸外科雜志;2010年01期

5 唐三元;曹建國;劉華清;;發(fā)酵乳酸桿菌對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長及免疫功能的影響[J];實(shí)用醫(yī)院臨床雜志;2007年01期

6 孟利,張?zhí)m威;乳酸菌胞外多糖的生理功能及其在食品中的應(yīng)用[J];現(xiàn)代食品科技;2005年04期

7 耿珊珊,蔡?hào)|聯(lián);短鏈脂肪酸對(duì)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖分化的影響[J];腸外與腸內(nèi)營養(yǎng);2005年05期

8 陳爾真,曹偉新,燕敏,費(fèi)旭峰,陳雪華;丁酸對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW1116增殖及分化狀態(tài)的影響[J];外科理論與實(shí)踐;2003年03期

9 王立生,潘令嘉,陳村龍,李明松,孫勇,張亞歷,周殿元;雙歧桿菌對(duì)裸鼠移植大腸癌增殖與凋亡的原位研究[J];世界華人消化雜志;2000年04期

本文編號(hào)：2865646