發(fā)布時間：2020-10-27 15:38

　　 研究背景和目的：肺癌是世界上發(fā)病率及死亡率增長最快的惡性腫瘤,并且繼續(xù)在上升,在中國和在大多數(shù)工業(yè)化國家中,肺癌已居各類惡性腫瘤死因的第一位。肺癌的產(chǎn)生是環(huán)境-遺傳因素共同作用所致,但具體的發(fā)病機制還沒有徹底明晰,但流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示在環(huán)境危險因素中,吸煙與肺癌發(fā)生發(fā)的風(fēng)險關(guān)系最密切,吸煙者罹患肺癌的風(fēng)險是非吸煙者的20倍,肺癌患者中80%以上與煙草依賴或成癮行為有關(guān)。與此同時,另外一種現(xiàn)象值得我們注意,就是吸煙者中卻僅有10%～15%會發(fā)生肺癌。這表明個體對肺癌的易感性存在差異,而導(dǎo)致這種差異的原因來源于遺傳的多態(tài)性。對于研究復(fù)雜性疾病的遺傳易感性比如肺癌,全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association studies, GWAS)是一種有效的手段,為研究者打開了一扇通往研究復(fù)雜疾病的大門。GWAS是在研究的目標人群中設(shè)病例組和對照組,使用單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)作為兩組關(guān)聯(lián)分析的遺傳標記,對照分析兩組間的全基因組差別,進而有希望發(fā)現(xiàn)影響疾病發(fā)生的遺傳特征。如果病例組較對照組相比,病例組中出現(xiàn)了某個SNP位點的等位基因或基因型出現(xiàn)的頻率顯著改變,則認為SNP位點可能與疾病的發(fā)病風(fēng)險相關(guān),最后,研究者通過基因定位和連鎖不平衡分析確定疾病可能的易感基因。目前在全世界范圍內(nèi)進行的GWAS已經(jīng)為肺癌篩選出一批遺傳易感性相關(guān)的常見基因變異,例如尼古丁乙酰膽堿受體和CYP2A6功能相關(guān)的基因變異位點,這些位點的遺傳多態(tài)性可增加或降低個體罹患肺癌的風(fēng)險。以上研究結(jié)果提示通過檢測與罹患肺癌風(fēng)險相關(guān)的遺傳學(xué)分子標志,有助于進行肺癌病因?qū)W研究及篩選肺癌高危人群。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指基因組DNA中由于某個單個核苷酸發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛倒、插入或缺失等變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP在人類基因組中具有數(shù)量眾多、分布廣泛和穩(wěn)定遺傳等特點,SNP可能發(fā)生在基因的編碼序列上,亦可發(fā)生在非編碼序列上。根據(jù)SNP在基因中的不同位置,可分為基因調(diào)控區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Regulatory SNP,rSNP)和基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Coding SNP, cSNP)。根據(jù)基因編碼區(qū)SNP是否改變編碼的氨基酸序列,cSNP又可分為同義cSNP (Synonymous cSNP)和非同義cSNP (Non-synonymous cSNP)。同義cSNP指堿基序列的改變并不引起蛋白質(zhì)的氨基酸序列變化；非同義cSNP的變異可以改變編碼的氨基酸殘基的種類,進而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的變化。另外,rSNP則可以通過影響與轉(zhuǎn)錄因子或miRNA的結(jié)合,引起基因表達水平的改變或mRNA的穩(wěn)定性及翻譯過程的變化,進而影響細胞正常功能�？偟膩碚f,這些潛在功能性SNPs通常會被優(yōu)選用來探討與疾病發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系,進而為包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的防治及臨床治療策略提供科學(xué)依據(jù)。SNP與肺癌易感性關(guān)系的研究是目前肺癌研究領(lǐng)域的一個熱點,并且在世界多個地區(qū)進行的GWAS已經(jīng)尋找到一些影響肺癌發(fā)病風(fēng)險的易感基因位點和染色體區(qū)域。例如,尼古丁基因家族成員CHRNA3、CHRNB4、CHRNB2 (cholinergic receptor, nicotinic, α3,β4 and β2)可編碼煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs),與個體的吸煙行為有關(guān)。過去研究認為nAChRs僅存在于神經(jīng)系統(tǒng),但是最近研究已證實,nAChRs也分布在肺支氣管上皮細胞上,而且在肺癌的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用。煙堿型乙酰膽堿受體屬于配體門控離子通道超家族,可被乙酰膽堿、膽堿和尼古丁激活,參與尼古丁和煙草亞硝胺的調(diào)節(jié),而尼古丁和煙草亞硝胺正是吸煙相關(guān)肺癌的主要致癌物。此外,尼古丁與細胞表面的nAChRs受體蛋白結(jié)合,通過多種途徑影響腫瘤的進展,如細胞增殖、侵襲和間質(zhì)血管的生成,同時還能保護腫瘤細胞逃避程序性死亡,發(fā)揮抑制腫瘤細胞凋亡的作用。CHRNA3基因編碼的乙酰膽堿α3亞基蛋白能結(jié)合煙草專有的致癌物NNK,導(dǎo)致癌基因的激活,從而促進腫瘤細胞的增殖,增加機體罹患肺癌風(fēng)險。此外,別的致癌物質(zhì)如亞硝胺作用于nAChRs蛋白后,能促進腫瘤血管和腫瘤細胞生長,與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。來自冰島、法國、美國和英國的獨立GWAS結(jié)果亦證實遺傳易感性與肺癌的發(fā)病風(fēng)險關(guān)系密切。四組研究人員通過對肺癌患者和健康人群的病例-對照分析,均驗證了染色體15q24-25區(qū)域編碼：nAChR:基因家族的多個SNPs位點多態(tài)性對肺癌發(fā)病風(fēng)險的影響作用。然而,在韓國、日本及中國人群中的研究卻未能重復(fù)該實驗結(jié)果,其原因可能是因為這些多態(tài)性位點的最小等位基因頻率(Minor Allele Frequency,MAF)分布在亞洲人群中較低。以上的研究結(jié)果提示肺癌的易感基因位點的分布存在著種族和地域的不同。因此,在我國人群中進行基因多態(tài)性與肺癌發(fā)病關(guān)聯(lián)的研究是非常有必要的,我們可以從中尋找出中國人群的肺癌易感位點,為我國肺癌高危人群的篩查以及個體化預(yù)防和治療奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。位于染色體1q21區(qū)域的CHRNB2 (cholinergic receptor nicotinicβ2)基因、位于15q25.1區(qū)域的CHRNA3基因和CHRNB4基因(cholinergic receptor nicotinic α3 and β4)及位于20q13.2區(qū)域的基因CHRNA4(cholinergic receptor nicotinic α4。以上基因編碼的煙堿乙酰膽堿受體(nAChRs)可能會影響個體吸煙行為和煙草成癮性,也涉及煙草致癌物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控,可以抑制細胞凋亡、促進腫瘤增殖,與肺癌的發(fā)生關(guān)系密切。盡管在歐美及亞洲人群中均有該基因家族的變異位點與肺癌的發(fā)病風(fēng)險關(guān)聯(lián)的報道,但產(chǎn)生該關(guān)聯(lián)的機制是直接作用于癌變的分子通路還是通過影響吸煙行為間接作用于癌變的分子通路,亦或是二者的協(xié)同作用所致,目前尚無定論。尼古丁受體基因家族的位點發(fā)生突變,結(jié)果可能增加個體的吸煙量,故研究人員認為,基因多態(tài)性影響吸煙行為,從而提高機體肺癌產(chǎn)生的風(fēng)險。例如日本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1q21區(qū)域的rs4845652 T等位基因攜帶者有較低的尼古丁依賴性(nicotine dependence,Nd),同時證明了CHRNA4、CHRNB2基因與基因的相互作用影響Nd,比如那些同時攜帶有CHRNA4rs1044397 GG或GA基因型和CHRNB2 CC基因型的吸煙者Nd較高。另外冰島的GWAS研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)染色體15q24-25區(qū)域上rs1051730位點的遺傳變異與煙草成癮行為有關(guān),可導(dǎo)致個體的吸煙量及罹患肺癌的風(fēng)險增加。然而,歐美學(xué)者進行的GWAS卻得出了不同的結(jié)論,其研究結(jié)果表明染色體15q25區(qū)域rs1051730和rs8034191位點的多態(tài)性變化與吸煙量及Nd無關(guān)。CYP2A6基因位于人類19號染色體長臂的19q12-19q13.2區(qū)域,超過6000個堿基對,包含9個外顯子,編碼494個氨基酸,其編碼香豆素7-羥化酶,在生理過程藥物代謝及毒物代謝中發(fā)揮著重要的作用,特別是在外源性化學(xué)物質(zhì)的代謝中,參與許多前致癌物的代謝活化,例如黃曲霉毒素B1,亞硝胺,1,3-丁二烯等。CYP2A6是表達在人類呼吸道中的P450酶,負責(zé)將煙草中大量的致癌物質(zhì)如NNK、NNAL、NNN等強致癌物活化,而NNK是TSNA中最強的一種致癌物,也是煙草中含量最多的肺致癌物,對肺組織有高度的親和性,被認為是煙草中可能引起肺癌重要成分之一。CYP2A6可能以缺失和重復(fù)基因的形式存在,另外它還包含了基因轉(zhuǎn)換、核苷酸缺失、核苷酸插入以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)的形式。根據(jù)CYP2A6對其特異底物的代謝能力不同,分為強代謝個體(EMs)和弱代謝(PMs)個體。影響CYP2A6活性一個重要因素就是其的基因多態(tài)性,目前有近30種的CYP2A6基因突變被發(fā)現(xiàn),CYP2A6*1是野生型純合子。CYP2A6*2是L160H的突變,被認為是導(dǎo)致歐洲人群弱代謝個體的主要突變。CYP2A6*3是基因轉(zhuǎn)位引起的變異,而CYP2A6*4是基因3非編碼區(qū)域的缺失引起的變異,也被認為是導(dǎo)致亞洲人群中弱代謝個體的主要突變類型,頻率高達15%-20%,我國研究者在CYP2A6表型的研究中就發(fā)現(xiàn)中國人群PMs頻率高達13.3%,與CYP2A6*4在亞洲人群高頻率突變有一定關(guān)系。CYP2A6等位基因頻率在不同種族之間的分布存在很大差別,大多數(shù)等位基因在亞洲人群中的頻率較高。另外,根據(jù)CYP2A6基因型把CYP2A6對尼古丁的代謝能力分為正常代謝(normal,100%)、中間代謝(intermediate,75%左右)、慢代謝(slow,50%-25%)、低代謝(poor,25%)四組。目前在不同種族進行關(guān)于CYP2A6和肺癌易感性的研究,出現(xiàn)的不一致甚至矛盾的結(jié)果。基于以上研究結(jié)果的不一致性,有必要在不同種族及不同吸煙狀態(tài)的人群中對基因多態(tài)性與肺癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)進行驗證,并探討遺傳風(fēng)險和其他環(huán)境因素對易感基因功能的可能影響。目前,雖然肺癌的易感基因研究已取得很大進展,但大部分數(shù)據(jù)是以西方人群為基礎(chǔ),有關(guān)中國漢族人群的研究數(shù)據(jù)仍十分缺乏,因此針對中國人群肺癌的病因?qū)W研究尤為重要。本課題旨在通過病例-對照分析,探討染色體nAChR基因SNP和CYP2A6基因多態(tài)性與中國南方男性肺癌發(fā)病的相關(guān)性,從而為肺癌高危人群的篩查、早期診斷和個體化治療提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。實驗將研究對象限定在中國南方男性肺癌患者,挑選出了5個肺癌可能易感的尼古丁乙酰膽堿受體SNP位點,同時選擇了CYP2A6五個多態(tài)性位點檢測。利用iMLDR技術(shù)在中國南方肺癌患者和健康對照者中進行mAChR基因多態(tài)性分型；同時采用多重LONG-PCR電泳與SNaPshot相結(jié)合的方法對CYP2A6進行基因多態(tài)性檢測并整理檢測結(jié)果,利用SPSS13.0軟件進行相關(guān)統(tǒng)計分析。探討各個位點的多態(tài)性分布與肺癌患病風(fēng)險的關(guān)系,驗證中國南方男性肺癌易感SNP位點。綜合以上數(shù)據(jù)為中國南方男性肺癌高危人群的確定及個體化預(yù)防和治療奠定初步的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù),也為下一步建立適合中國南方男性的肺癌易感基因風(fēng)險評估模型做準備。研究方法：1.研究對象病例組來源于2013年5月至10月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收集的經(jīng)病理證實為肺癌的204例患者。對照組為來自同期體檢中心無腫瘤病史及相關(guān)肺疾病的健康人群821例。研究對象均來源于中國南方男性,采集所有研究對象外周血樣本。2.SNP位點的挑選從NCBI的SNP信息數(shù)據(jù)庫、全基因組關(guān)聯(lián)分析以及其它國內(nèi)外大樣本研究得到的陽性位點中挑選出了5個肺癌可能易感的尼古丁乙酰膽堿受體SNP位點,具體為：位于CHRNA3基因的rs6495308；位于CHRNB4基因的rs11072768；位于CHRNA4基因的rs3787140及位于CHRNB2基因的rs2072659和rs2072660；同時選擇了CYP2A6*4、CYP2A6*5、CYP2A6*7、 CYP2A6*9和CYP2A6*10五個CYP2A6多態(tài)性位點檢測。3.基因分型與數(shù)據(jù)分析利用iMLDR技術(shù)在中國南方肺癌患者和健康對照者中進行nAChR基因多態(tài)性分型：同時采用多重LONG-PCR電泳與SNaPshot相結(jié)合的方法對CYP2A6進行基因多態(tài)性檢測并整理檢測結(jié)果,利用SPSS13.0軟件進行相關(guān)統(tǒng)計分析。探討各個位點的多態(tài)性分布與肺癌患病風(fēng)險的關(guān)系,驗證中國南方男性肺癌易感SNP位點。4.對各位點多態(tài)性與肺癌患者的吸煙狀態(tài)、病理類型、解剖位置等相關(guān)性進行分析；探討基因型分布與吸煙行為在肺癌中的交互作用。5.探討nAChR基因多態(tài)性之間、nAChR與CYP2A6基因多態(tài)性之間對肺癌發(fā)生存在的交互作用。結(jié)果：第一部分nAChR和CYP2A6基因多態(tài)性與肺癌發(fā)生的關(guān)系本研究選取了尼古丁乙酰膽堿受體基因的5個SNPs位點,在204例南方男性肺癌患者和821例健康對照人群中進行了基因分型和統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示,除rs11072768外,其它4個位點的基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05),病例對照分析發(fā)現(xiàn)1個與肺癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)的多態(tài)性位點,即位于CHRNB2基因上的rs2072660位點,與C/C基因型相比,C/T基因型攜帶者的肺癌發(fā)生的風(fēng)險升高,OR值(95%CI)為1.708(1.169-2.496),P=0.006。本研究對204例南方男性肺癌患者和821例健康對照人群中的CYP2A6代謝分型進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示,與正常代謝組相比,中間代謝組、慢代謝組肺癌發(fā)生的風(fēng)險降低,OR值(95%CI)分別為0.142(0.041-0.485),P0.001、0.561(0.316-0.996),P0.048。低代謝組肺癌發(fā)生的風(fēng)險升高,OR值(95%CI)為2.334(1.552-3.581),P0.001。本研究分析結(jié)果顯示對肺癌組各基因多態(tài)性與患者的病理類型無關(guān)；但就解剖位置而言,CHRNB2 rs2072659的G/G基因型可增加發(fā)生非周圍型肺癌的風(fēng)險,OR值(95% CI)為8.360(1.153-60.623), CYP2A6低代謝型發(fā)生周圍型肺癌的風(fēng)險降低,OR值(95% CI)為0.453(0.223-0.921)。第二部分nAChR和CYP2A6基因多態(tài)性及基因型-基因型間的交互作用對吸煙行為的影響本研究分析結(jié)果顯示CHRNB2rs2072660 C/T基因型較C/C基因型相比,發(fā)生吸煙的風(fēng)險降低(OR=0.710,95%CI=0.530-0.953);另外相對于CYP2A6正常代謝型而言,中間代謝(OR=5.809,95%CI=0.2611-12.924)、慢代謝型(OR=1.713,95%CI=1.107-2.649)者吸煙的風(fēng)險增加,而低代謝型(OR=0.466,95%CI=0.338-0.643)者發(fā)生吸煙的風(fēng)險降低。同時,進一步交互作用分析結(jié)果顯示CHRNA3rs6495308C/T基因型并CYP2A6代謝分型為低代謝者對吸煙行為的發(fā)生存在正交互作用(OR=2.000,95%CI:1.021-3.919),表明兩者同時存在的個體吸煙行為風(fēng)險增加。其余基因型之間對吸煙行為不存在交互作用。第三部分吸煙、nAChR、CYP2A6基因多態(tài)性三者間對肺癌發(fā)生的交互作用本研究對nAChR基因多態(tài)性之間對肺癌的交互作用、nAChR與CYP2A6基因多態(tài)性之間對肺癌的交互作用、吸煙與nAChR基因多態(tài)性之間對肺癌的交互作用、吸煙與CYP2A6基因多態(tài)性之間對肺癌的交互作用進行了分析。多因素logistic回歸分析結(jié)果表明：在控制年齡、職業(yè)、文化程度、吸煙和婚姻狀況等混雜因素之后,CHRNA3rs6495308C/T基因型并CHRNB2rs2072659G/C基因型者、CHRNA3rs6495308C/T基因型并CHRNA4rs3787140C/T基因型者CHRNA3rs6495308C/T基因型并CHRNB2rs2072660C/T基因型者對肺癌的發(fā)生均存在負交互作用,OR值分別為0.378 (95%CI:0.170～0.841)、0.268 (95%CI: 0.107～0.670)、0.277 (95%CI:0.124～0.620)。在控制年齡、職業(yè)、文化程度和婚姻狀況等混雜因素之后,CYP2A6代謝分型為低代謝并每天吸煙0-15支者(OR=13.194,95%CI:2.394～72.716)、CYP2A6代謝分型為低代謝并每天吸煙15支者(OR=4.348,95%CI:1.672～11.308)對肺癌的發(fā)生存在正交互作用。其余不存在交互作用。結(jié)論：1. 本研究結(jié)果顯示位于CHRNB2基因rs2072660位點與中國南方男性肺癌發(fā)生的風(fēng)險相關(guān),其中rs2072660位點C/T基因型可能增加個體肺癌發(fā)生的風(fēng)險；CHRNB2 rs2072659的G/G型可增高發(fā)生非周圍型肺癌的風(fēng)險,CYP2A61氏代謝型發(fā)生周圍型肺癌的風(fēng)險降低；CHRNB2rs2072660 C/T基因型發(fā)生吸煙的風(fēng)險降低,CYP2A6中間代謝、慢代謝型者吸煙的風(fēng)險增加,而低代謝型者發(fā)生吸煙的風(fēng)險降低。2. 交互作用分析結(jié)果顯示,CHRNA3rs6495308 C/T基因型并CYP2A6低代謝型者對吸煙行為的發(fā)生存在正交互作用；CHRNB2 rs2072660基因多態(tài)性與CHRNA3 rs6495308基因多態(tài)性對肺癌存在負交互作用,CHRNA3rs6495308基因多態(tài)性與CHRNB2 rs2072659基因多態(tài)性對肺癌存在負交互作用,CHRNA3 rs6495308基因多態(tài)性與CHRNA4 rs3787140基因多態(tài)性對肺癌負交互作用,CYP2A6基因多態(tài)性與吸煙行為對肺癌存在正交互作用。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

ＡＢＩＳＮＰｋｘＴＭ?Ａｓｓａｙ?等。??本研究中對于ｎＡＣｈＲ基因多態(tài)性的檢測采用的方法是ｉＭＬＤＲ技術(shù)，該技??術(shù)的原理為（圖３）；首先對于突變所在區(qū)段先采用多重ＰＣＲ反應(yīng)在一個體系??中獲得擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)過外切核酸酶及郵堿酶（ＥｘｏＩ／ＳＡＰ）純化后用于后續(xù)??１５??

Ｆｉｇ．３?Ｔｈｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?出ｅ?ｉＭＬＤ民化ｃｈｎｏｌｏｇｙ??對于ＣＹＰ２Ａ６基因多態(tài)性的檢測我們采用多重ＬＯＮＧ－ＰＣ民電泳與??ＳＮａＰｓｈｏｔ相結(jié)合的方法。ＳＮａＰｓｈｏｔ技術(shù)原理（見圖４）是首先使用引物擴增目??標ＳＮＰｓ所在片段，在擴增產(chǎn)物中加入核酸外切酶Ｉ?（Ｅｘｏ?Ｉ）和堿性磯酸酶??（Ｓｈｒｉｍｐ?Ａｌｋａｌｉｎｅ?Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，?ＳＡＰ）消化掉反應(yīng)體系中的引物序列和剩余的??腳ＴＰｓ；然后，Ｗ純化后的擴増產(chǎn)物為模板，使用測序酶、四種炎光標記ｄｄＮＴＰ??和５＇－端緊靠ＳＮＰ位點的延伸引物進行ＰＣＲ反應(yīng)，引物延伸一個堿基即終止，??經(jīng)ＡＢＩ測序儀檢測后，按照峰的移動位置確定該延伸產(chǎn)物對應(yīng)的ＳＮＰ位點，根??據(jù)峰的顏色可得知慘入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。其優(yōu)點在于：??１．分型準確；２．通量高：也稱小測序；３．檢測速度快；４．不受ＳＮＰ位點多態(tài)性特??性限制；５．不受樣本個數(shù)限制。??１７??

圖５?ＳＮａＰｓｈｏｔ毛細管電泳峰形圖??Ｆｉｇ．５?Ｔｈｅ?ｃａｐｉｌｌａｒｙ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐｅａｋ?ｇｒａｐｈ?ｏｆ?ＳＮａＰｓｈｏｔ??ｆ．統(tǒng)計分析??

本文編號：2858712