乳腺癌是女性最普遍的惡性疾病。與世界其他大多數(shù)國(guó)家一樣,乳腺癌也是中國(guó)女性最常見的癌癥,2008年,中國(guó)乳腺癌新發(fā)病例和死亡病例分別占全世界的12.2%和9.6%;而造成90%實(shí)體瘤病人死亡的根本原因是乳腺癌轉(zhuǎn)移。乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過程,它涉及到原位瘤細(xì)胞浸潤(rùn)并進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng),在新的微環(huán)境中產(chǎn)生轉(zhuǎn)移灶。然而乳腺癌是一種異質(zhì)性的疾病,可以分為腔膜樣型、基底細(xì)胞樣型、HER2過表達(dá)型和正常乳腺樣型等4種亞型。乳腺癌異質(zhì)性的特征也使得對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)估產(chǎn)生了很大的風(fēng)險(xiǎn),而且在治療上也非常困難。表皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)指的是在特定的生理或病理?xiàng)l件下,表皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣細(xì)胞的過程。主要表現(xiàn)為細(xì)胞表面粘附分子(如:E-cadherin)表達(dá)降低,細(xì)胞極性喪失,細(xì)胞骨架發(fā)生重塑,細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。EMT過程是胚胎發(fā)育中的一種正常生理活動(dòng),隨后也發(fā)現(xiàn)EMT在傷口愈合、炎癥反應(yīng)、組織重建、腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生導(dǎo)致細(xì)胞浸潤(rùn)能力增強(qiáng),因此EMT也被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的起始步驟之一。在分子水平上,E-cadherin表達(dá)缺失是EMT發(fā)生的最重要標(biāo)志事件。此外,很多轉(zhuǎn)錄因子,如Snail、Twist、ZEB1、ZEB2和FOXC2等均可以通過直接或間接的抑制E-cadherin啟動(dòng)子的活性誘導(dǎo)EMT發(fā)生。近年來,越來越多的研究表明:表觀遺傳修飾參與E-cadherin的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。組蛋白去乙�；窰DAC1/2、組蛋白去甲基化酶LSD1、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a和Suv39H1、以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶等都可以抑制E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄。表觀遺傳修飾調(diào)控的失調(diào)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān),在該領(lǐng)域的研究有助于揭示人類腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的新機(jī)制。PRMT7屬于精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族的Ⅱ型成員,參與介導(dǎo)組蛋白或非組蛋白的對(duì)稱性二甲基化修飾。已有的研究表明,PRMT7可以參與男性印記基因甲基化、核糖體RNA的組裝、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞分化等多項(xiàng)生理活動(dòng)。但是現(xiàn)在還沒有關(guān)于PRMT7參與腫瘤發(fā)生或轉(zhuǎn)移的報(bào)道。我們的免疫組化結(jié)果表明:PRMT7在乳腺癌組織中高水平表達(dá);同時(shí)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)的分析也進(jìn)一步證實(shí)了我們的結(jié)論。在細(xì)胞水平上,我們發(fā)現(xiàn)PRMT7在惡性乳腺癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá),而且過表達(dá)PRMT7可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移。在過表達(dá)PRMT7誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程中,E-cadherin等表皮markers表達(dá)下調(diào);而N-cadherin等間質(zhì)markers表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),PRMT7能夠抑制表皮marker E-cadherin啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,轉(zhuǎn)錄因子YY1能夠與PRMT7和HDAC3直接結(jié)合,并招募二者到E-cadherin啟動(dòng)子上發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用;在此過程中,PRMT7介導(dǎo)的H4R3me2s修飾水平在E-cadherin啟動(dòng)子上增加,同時(shí)伴隨著H3K4me3、H3Ac和H4Ac修飾水平的減少。相反,降低PRMT7表達(dá)后,E-cadherin水平有所恢復(fù),這主要是因?yàn)镋-cadherin啟動(dòng)子上H4R3me2s修飾減少,而H3K4me3和H4Ac修飾增加。我們的研究表明精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT7是乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要誘導(dǎo)因子,同時(shí)我們也揭示了乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移的一種新的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。該研究成果為開發(fā)靶向PRMT7治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌提供了重要理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R737.9
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
第一部分 研究背景
    一、表皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系
        （一） 表皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換
        （二） 腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移
        （三） EMT與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系
    二、EMT的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制
        （一） EMT與DNA甲基化
        （二） EMT與組蛋白修飾
        （三） EMT與非組蛋白修飾
        （四） EMT與miRNAs介導(dǎo)的翻譯后修飾
    三、人PRMT7 研究進(jìn)展
        （一） PRMTs家族簡(jiǎn)介
        （二） PRMT7 的功能與作用機(jī)制
    四、轉(zhuǎn)錄因子YY1 和去乙酰化酶HDAC3 的研究進(jìn)展
        （一） YY1 的發(fā)現(xiàn)
        （二） YY1 的功能
        （三）HDAC3 的研究概述
    五、本論文研究?jī)?nèi)容及意義
        （一） 立題依據(jù)
        （二） 研究?jī)?nèi)容及意義
第二部分 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    一、實(shí)驗(yàn)材料
        （一） 實(shí)驗(yàn)儀器
        （二） 試劑
        （三） 抗體
        （四） 質(zhì)粒
        （五） 細(xì)胞系
    二、實(shí)驗(yàn)方法
        Ⅰ、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法
            （一） 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
            （二） 干涉質(zhì)粒構(gòu)建
            （三） 質(zhì)粒提取方法
            （四） RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR
            （五） 免疫印跡（Western Blot）
            （六） 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（CoIP）
            （七）染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）
            （八） ChIP-re- ChIP實(shí)驗(yàn)
            （九）蛋白純化及GST pull down實(shí)驗(yàn)
            （十） 免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IF）
        Ⅱ、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法
            （一） 細(xì)胞培養(yǎng)
            （二） 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
            （三） 慢病毒的包裝及侵染
            （四）報(bào)告基因檢測(cè)
            （五）細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)
            （六）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
            （七）明膠酶譜實(shí)驗(yàn)
            （八） MTT細(xì)胞活力檢測(cè)
        Ⅲ、臨床病理及活體實(shí)驗(yàn)
            （一）免疫組化實(shí)驗(yàn)（IHC）
            （二） 蘇木精-伊紅染色（HE）
            （三）裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)
            （四）裸鼠轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)
        Ⅳ、統(tǒng)計(jì)分析
第三部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    一、PRMT7 的表達(dá)與乳腺癌惡性程度正相關(guān)
        （一） PRMT7 在高轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)
        （二） PRMT7 在乳腺癌組織中表達(dá)高于癌旁組織
    二、PRMT7 異常表達(dá)誘導(dǎo)EMT發(fā)生
        （一） PRMT7 過表達(dá)誘導(dǎo)乳腺表皮細(xì)胞發(fā)生EMT
        （二）PRMT7 過表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT
        （三）降低PRMT7 表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)EMT發(fā)生
    三、PRMT7 促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲
        （一） PRMT7 過表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力
        （二）降低PRMT7 表達(dá)抑制細(xì)胞的遷移和侵襲
    四、PRMT7 介導(dǎo)的EMT進(jìn)程中，E-cadherin啟動(dòng)子上表觀遺傳修飾的變化
        （一） PRMT7 抑制E-cadherin啟動(dòng)子的活性
        （二） E-cadherin啟動(dòng)子上H4R3me2s修飾水平增加伴隨著H3K4me3 減少
        （三） H4R3me2s與組蛋白乙�；揎椫g存在crosstalk
    五、YY1 招募PRMT7/HDAC3 復(fù)合物抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄
        （一） PRMT7 與YY1 和HDAC3 存在于同一復(fù)合物中
        （二） YY1 與HDAC3 直接結(jié)合
        （三） YY1 招募PRMT7/HDAC3 到E-cadherin啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制
    六、PRMT7 促進(jìn)乳腺癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移
        （一） PRMT7 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移
        （二） PRMT7 抑制乳腺癌原位瘤的生長(zhǎng)
第四部分 討論
    一、PRMT7 與腫瘤轉(zhuǎn)移
    二、表觀修飾與EMT
    三、YY1-PRMT7-HDAC3 三元復(fù)合物
    四、EMT與腫瘤細(xì)胞干性
主要結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)
    一、主要結(jié)論
    二、創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄一
附錄二
附錄三
致謝
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