研究背景及目的:業(yè)已證明TNF-α具有促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。然而作為TNF-α-TNFR1信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白R(shí)IP1(receptor-interacting protein-1,受體相互作用蛋白-1),其對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展的作用及其具體的分子機(jī)制鮮見報(bào)道。本研究擬圍繞以下問題開展實(shí)驗(yàn):RIP1在膽囊癌中的表達(dá)及與臨床參數(shù)之間的關(guān)系;進(jìn)一步進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),探討RIP1對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及對(duì)VEGF-C表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法:收集60例膽囊癌和17例癌旁正常組織石蠟標(biāo)本,通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)RIP1的蛋白表達(dá);結(jié)合臨床資料分析RIP1表達(dá)與臨床參數(shù)間的關(guān)系。通過RT-PCR和Western-blot技術(shù)檢測(cè)3個(gè)膽囊癌細(xì)胞株中RIP1的表達(dá)情況。通過RNAi技術(shù)特異性的沉默膽囊癌細(xì)胞中RIP1;RT-PCR、Western-blot驗(yàn)證;通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RIP1基因沉默對(duì)膽囊癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。通過Western-blot分析RIP1基因沉默對(duì)AKT、p-AKT、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)、c-jun(AP-1)、p-c-jun(p-AP-1)、VEGF-C蛋白表達(dá)的影響。構(gòu)建VEGF-C啟動(dòng)子截短缺失體片段及各個(gè)突變體雙熒光素酶報(bào)告載體,用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各啟動(dòng)子片段活性,確定VEGF-C啟動(dòng)子關(guān)鍵活性區(qū)域,通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)關(guān)鍵活性區(qū)域存在關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、通過重疊PCR方法定點(diǎn)誘變技術(shù)突變特定轉(zhuǎn)錄因子位點(diǎn)對(duì)VEGF-C啟動(dòng)子活性的影響、進(jìn)一步細(xì)胞外實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳遷移率阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)和活體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Ch IP)確定RIP1通過NF-κB和AP-1調(diào)控VEGF-C基因啟動(dòng)子的活性。結(jié)果:1 RIP1在膽囊癌組織中的表達(dá)(MOD值=0.3134±0.0802)顯著高于膽囊正常組織(MOD值=0.1345±0.1220),P0.0001;RIP1的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)無關(guān);而RIP1的表達(dá)與膽囊癌患者的臨床分期(I~III vs.IV~V;P=0.0021)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無轉(zhuǎn)移組vs.有轉(zhuǎn)移組;P=0.047)和有無結(jié)石(有結(jié)石vs.無結(jié)石;P=0.0382)相關(guān)。2 RIP1的m RNA和蛋白在三株膽囊癌細(xì)胞系均有表達(dá),NOZ細(xì)胞RIP1蛋白表達(dá)最強(qiáng)。構(gòu)建的沉默質(zhì)粒P-1/si RNA—P-4/si RNA中P-1/si RNA最大程度沉默了NOZ細(xì)胞的RIP1表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05。P-1/si RNA組細(xì)胞增殖比NC/si RNA組和control組(即未轉(zhuǎn)染組)細(xì)胞緩慢(P0.05),而NC/si RNA組和control組細(xì)胞增殖無差異(P0.05)。P-1/si RNA組細(xì)胞穿到下室的細(xì)胞數(shù)比NC/si RNA組和control組細(xì)胞數(shù)目少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05;而NC/si RNA組和control組穿到下室的細(xì)胞數(shù)目無差異(P0.05)。P-1/si RNA、NC/si RNA和control組膽囊癌細(xì)胞的凋亡情況無差異。P-1/si RNA組細(xì)胞中AKT、p-AKT、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)、c-jun(AP-1)、pc-jun(p-AP-1)蛋白表達(dá)量比NC/si RNA組和control組表達(dá)量少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05;而NC/si RNA組和control組表達(dá)無差異(P0.05)。P-1/si RNA組VEGF-C m RNA和蛋白的表達(dá)量比NC/si RNA組和control組表達(dá)量減少,結(jié)果有顯著差異P0.05;而NC/si RNA組和control組VEGF-C m RNA和蛋白表達(dá)無差異(P0.05)。3-332bp到-190bp是VEGF-C啟動(dòng)子保持轉(zhuǎn)錄表達(dá)活性的關(guān)鍵區(qū)域。VEGF-C啟動(dòng)子片段PGL3B-332的熒光活性隨著RIP1的表達(dá)升高而升高,呈劑量效應(yīng)增加;發(fā)現(xiàn)VEGF-C啟動(dòng)子-332bp至-190bp區(qū)域存在兩個(gè)交錯(cuò)重疊的AP-1位點(diǎn)(-207 to-192bp GGCGCGTCAGTCATG;兩個(gè)AP-1位點(diǎn)分別為:GGCGCGTCAGT和CGTCAGTCATG),調(diào)控VEGF-C啟動(dòng)子活性。4證實(shí)RIP1可激活NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在VEGF-C啟動(dòng)子-332bp至-190bp區(qū)域,增強(qiáng)VEGF-C啟動(dòng)子活性;結(jié)論:1 RIP1在膽囊癌組織中的表達(dá)顯著增加;RIP1的表達(dá)與膽囊癌患者的臨床分期、有無結(jié)石以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。2 RIP1促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖和侵襲,對(duì)凋亡無影響;RIP1促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞RIP1-NF-κB/AP-1-VEGF-C信號(hào)通路分子的表達(dá)。3-332bp到-190bp是VEGF-C啟動(dòng)子保持轉(zhuǎn)錄表達(dá)活性的關(guān)鍵區(qū)域。在VEGFC啟動(dòng)子-332bp到-190bp區(qū)域存在兩個(gè)AP-1結(jié)合位點(diǎn),是調(diào)控VEGF-C啟動(dòng)子活性的重要位點(diǎn)。4 RIP1通過NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子與VEGF-C基因啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合調(diào)控VEGF-C啟動(dòng)子的活性,從而影響VEGF-C的表達(dá)。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R735.8
【文章目錄】：
英文縮略詞表
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分RIP1在膽囊癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
    引言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
第二部分RIP1沉默對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響及機(jī)制
    引言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
第三部分RIP1調(diào)控膽囊癌細(xì)胞分泌VEGF-C的分子機(jī)制
    引言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述:RIP1:細(xì)胞存活與腫瘤
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間完成的學(xué)術(shù)論文
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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1 張利霞;沈云志;邱全興;汪良芝;秦怡;;膽汁中IL-6、TNF-α、IL-8檢測(cè)對(duì)急性膽管炎診斷和嚴(yán)重程度的判斷價(jià)值[J];國(guó)際消化病雜志;2008年04期

本文編號(hào)：2844168