腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是我國泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率僅次于膀胱癌的惡性腫瘤,約占所有惡性腫瘤發(fā)病率的3%。受生活環(huán)境變化和診斷手段的提高影響,近年來國內(nèi)外腎細(xì)胞癌發(fā)病率均呈現(xiàn)明顯的增長趨勢,已經(jīng)成為威脅人類健康的最重要?dú)⑹种弧ＤI透明細(xì)胞癌是腎細(xì)胞癌的重要組成部分,約占所有腎細(xì)胞癌總發(fā)病率的70-80%。到目前為止,腎細(xì)胞癌的治療仍以傳統(tǒng)手術(shù)和放化療等治療手段為主,但由于腎細(xì)胞癌發(fā)病隱匿和診斷手段受限等影響,大部分患者就診時(shí)已到了腎細(xì)胞癌的中晚期并伴有不同程度的轉(zhuǎn)移,手術(shù)后易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),患者預(yù)后效果較差。免疫療法是治療終末期腎細(xì)胞癌的重要輔助手段之一,但受該手段應(yīng)答靈敏度較小且具有一定的細(xì)胞毒性的限制,其臨床應(yīng)用效果并不太理想。因此深入研究腎細(xì)胞癌及其轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,優(yōu)化腎細(xì)胞癌治療方案并開發(fā)腎細(xì)胞癌治療的新靶向藥物已經(jīng)成為臨床工作的研究熱點(diǎn)之一。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫對已有的轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌腫瘤樣本芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù),采用生物信息學(xué)方法篩選腎透明細(xì)胞癌腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的特異性差異表達(dá)基因,并對這些基因進(jìn)行功能注釋和生物學(xué)功能分析。同時(shí),通過分析差異表達(dá)基因編碼蛋白之間的相互作用來構(gòu)建蛋白與蛋白間相互作用的網(wǎng)絡(luò)及與相關(guān)小分子藥物相互關(guān)聯(lián)分析,為腎透明細(xì)胞癌的臨床診斷和藥物控制治療提供一定的數(shù)據(jù)支持。首先,通過GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE47352(包括4個(gè)早期轉(zhuǎn)移和5個(gè)未轉(zhuǎn)移腎透明細(xì)胞癌樣本)和GSE22541(包括44例轉(zhuǎn)移和24例未轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌組織樣本)的芯片數(shù)據(jù),采用R語言limma包中的t檢驗(yàn)根據(jù)基因表達(dá)差異篩選轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移腫瘤組織樣本中的差異表達(dá)基因。本研究中,在GSE47352數(shù)據(jù)集中共篩選得到359個(gè)差異表達(dá)基因,包括196個(gè)上調(diào)和163個(gè)下調(diào)基因。同時(shí),在GSE22541進(jìn)行差異基因篩選后共得到2623個(gè)差異表達(dá)基因,包括847個(gè)上調(diào)和1776個(gè)下調(diào)基因。然后,根據(jù)差異表達(dá)基因表達(dá)值進(jìn)行聚類分析,再通過通路和功能分類對篩選的差異表達(dá)基因潛在的生物學(xué)功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究,并根據(jù)基因重要的功能和通路構(gòu)建差異表達(dá)基因編碼蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò),同時(shí)通過Cmap搜索與疾病密切關(guān)聯(lián)的藥物小分子。最后,在細(xì)胞水平上對驗(yàn)證的基因進(jìn)行生物學(xué)功能的進(jìn)一步分析。對GSE47352芯片中篩選得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行信號通路分析后共顯著富集到5條信號通路,其中腎細(xì)胞癌是最顯著富集的通路,富集的相關(guān)基因包括EPAS1、ETS1、JUN、SOS2、TGFB2和PTPN11。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)JUN(連接度=6)有可能是蛋白相互作用的中心節(jié)點(diǎn)。藥物小分子的分析結(jié)果顯示,毒胡蘿卜內(nèi)酯對腎透明細(xì)胞癌具有非常高的抗癌作用。同時(shí),對GSE22541中的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能及信號通路分析發(fā)現(xiàn),上調(diào)基因主要顯著富集在細(xì)胞外基質(zhì)受體配體相互作用、癌癥通路、黏著斑等相關(guān)通路上,而下調(diào)基因主要顯著富集在神經(jīng)因子信號通路、胰島素信號通路和溶酶體信號通路。上、下調(diào)蛋白的蛋白相互作用分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),ITGA2、CDK1、COL1A1、MMP2和DCN是上調(diào)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白,而TP53、AKT1、EP300、HSP90AB1及RELA是下調(diào)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白。為尋找具有代表性的差異表達(dá)基因,本研究對兩組芯片篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,取其共有的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。結(jié)果共篩選到7個(gè)共有的上調(diào)表達(dá)基因和12個(gè)共有的下調(diào)表達(dá)基因。功能聚類分析后其主要集中在肌肉器官發(fā)展中的方面,而無顯著的信號通路富集。最后,采用實(shí)時(shí)定量PCR對共有的差異基因表達(dá)情況在臨床腫瘤組織樣本和細(xì)胞水平上進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與非轉(zhuǎn)移的原發(fā)性腎透明細(xì)胞癌組織相比,GPRC5A、RAB25、SGCD和KRT7的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌組織中顯著提高;同時(shí),SLC6A19、SULT1C4、NFKBIL1和INF的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌組中顯著降低,與生物信息學(xué)的分析結(jié)果一致。同時(shí),在細(xì)胞水平上我們也發(fā)現(xiàn),SGCD和KRT7在癌細(xì)胞系CAKI中的表達(dá)水平顯著高于正常腎細(xì)胞系,而SULTIC4的表達(dá)水平則顯著低于正常腎細(xì)胞系。敲低KRT7的表達(dá)水平則能夠顯著抑制CAKI細(xì)胞的遷移能力。總而言之,本研究通過對比兩組轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移的原發(fā)性腎透明細(xì)胞癌的組織芯片中基因表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)了19個(gè)共有的差異表達(dá)基因,并對其進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),GPRC5A、RAB25、SGCD、KRT7、SLC6A19、SULT1C4、NFKBIL1和INF可能在腎透明細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步細(xì)胞水平上的功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),敲低KRT7的表達(dá)能夠顯著抑制CAKI細(xì)胞的遷移能力,提示KRT7能夠通過促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌的遷移而進(jìn)一步促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程。因此,深入研究這些基因在腎透明細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移過程中的分子機(jī)制,對于幫助和提高腎透明細(xì)胞癌的臨床治療具有重要指導(dǎo)意義。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.11
【文章目錄】：
中文摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 腎癌
        1.1.1 腎癌的流行病學(xué)
        1.1.2 病理生理學(xué)及遺傳因素
        1.1.3 腎癌的診斷
        1.1.4 轉(zhuǎn)移性腎癌治療
    1.2 基因芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析
        1.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理
        1.2.2 差異表達(dá)基因分析
        1.2.3 聚類分析
        1.2.4 生物信息學(xué)的研究意義
    1.3 本研究的目的與意義
第2章 轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌生物靶標(biāo)識別
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 芯片數(shù)據(jù)來源
        2.2.2 芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理
        2.2.3 差異表達(dá)基因篩選
        2.2.4 差異表達(dá)基因聚類分析
        2.2.5 差異基因功能、通路富集分析
        2.2.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
        2.2.7 相關(guān)藥物小分子的篩選
    2.3 結(jié)果
        2.3.0 差異表達(dá)基因篩選
        2.3.1 兩種組織樣本基因表達(dá)的差異程度比較
        2.3.2 差異基因功能、通路富集分析
        2.3.3 差異表達(dá)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建
        2.3.4 相關(guān)藥物小分子的篩選
    2.4 討論
第3章 芯片數(shù)據(jù)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及代謝通路分析
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 表達(dá)譜數(shù)據(jù)獲取
        3.2.2 表達(dá)譜數(shù)據(jù)預(yù)處理
        3.2.3 差異基因識別
        3.2.4 差異表達(dá)基因的功能富集分析
        3.2.5 差異基因的通路聚類分析
        3.2.6 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)
        3.2.7 網(wǎng)絡(luò)模塊分析
        3.2.8 疾病相關(guān)miRNA的預(yù)測
        3.2.9 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理
        3.3.2 差異表達(dá)基因篩選
        3.3.3 差異表達(dá)基因的功能富集
        3.3.4 差異表達(dá)基因的功能聚類分析
        3.3.5 重要通路展示
        3.3.6 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)
        3.3.7 子網(wǎng)絡(luò)模塊分析
        3.3.8 miRNA-靶基因預(yù)測
        3.3.9 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析
    3.4 討論
第4章 兩組芯片差異表達(dá)基因綜合對比分析
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 兩組差異基因的對比
        4.2.2 共有差異基因的功能分析
        4.2.3 共有差異基因的相互作用分析
        4.2.4 TF調(diào)控靶基因關(guān)系預(yù)測與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 兩組差異基因的對比
        4.3.2 共有差異基因的功能分析
        4.3.3 共有差異表達(dá)蛋白的相互作用分析
        4.3.4 TF-靶基因關(guān)系預(yù)測
    4.4 討論
第5章 共有差異基因在轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移人腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)的驗(yàn)證
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 材料與試劑
        5.2.2 儀器與試劑
        5.2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)
        5.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 上調(diào)差異表達(dá)基因驗(yàn)證
        5.3.2 下調(diào)差異表達(dá)基因驗(yàn)證
    5.4 討論
第6章 細(xì)胞水平驗(yàn)證差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能
    6.1 引言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 細(xì)胞株
        6.2.2 儀器與試劑
        6.2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.3.1 不同遷移能力細(xì)胞中基因表達(dá)的檢測
        6.3.2 shKRT7對細(xì)胞增殖和遷移能力的影響
    6.4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者簡介及科研成果
致謝

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本文編號：2828950