研究背景:結直腸癌(colorectal cancer CRC)是一種發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤。全球范圍內,腸癌每年導致約600,000人死亡,約占癌癥死亡總數(shù)的8%。結直腸癌在男性癌癥患者中的發(fā)病率中高居第三位,而在女性癌癥患者中,發(fā)病率甚至高居第二位。以往的調查認為結直腸癌主要高發(fā)于發(fā)達國家,發(fā)病年齡約在50-60歲;而近期的調查顯示,發(fā)展中國家腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢,而且發(fā)病年齡也呈現(xiàn)年輕化。CRC發(fā)病因素復雜,確切的致病因素仍然不明;目前認為引起腸癌發(fā)生發(fā)展的原因主要包括環(huán)境和遺傳因素兩大類。15%-30%的CRC患者具有明確的家族遺傳病史,如家族腺瘤性息肉病、遺傳性非息肉性腸癌,均可通過引起染色體畸變而引起腸癌。而環(huán)境因素在腸癌的發(fā)病中的作用越來越得到重視,如人種地域的分布差異、營養(yǎng)物質的過度攝入、肥胖、腸道菌群的失調、吸煙、飲酒等;不僅可以誘發(fā)腸癌,而且對腸癌的發(fā)展也可能起到了促進作用。飲酒與疾病之間的發(fā)展關系復雜,雖然有研究表明,適量的飲酒對人體健康有益;但是越來越多的研究證實,飲酒與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關。過去40年中,全球人均飲酒量上升了約一倍,而在亞洲地區(qū)上升的尤為明顯。統(tǒng)計學顯示約3.6%的癌癥發(fā)生與慢性飲酒有關,酒精可以通過引起細胞色素酶的增高從而增強前致癌物如含酒精性的飲料、煙草、高脂飲食、化學致癌物質等致癌作用;酒精通過乙醇脫氫酶的而產生的一級代謝產物是乙醛,乙醛可以通過引DNA的甲基化從而引起DNA的損傷。酒精可以引起氧化應激反應,產生的活性含氧物質可以引起脂質體的過氧化,過氧化產物如4羥基壬烯酸可以引起DNA的突變;而近期研究表明,飲酒可以加速癌癥患者病程的進展,其中就包括可以引起癌細胞的轉移。腫瘤轉移引起癌癥患者死亡率增高的重要原因之一,統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,腸癌手術后五年生存率約在66%左右;而一旦發(fā)生轉移(包括臨近器官的浸潤轉移,血運系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)的轉移及器官的種植轉移),術后的五年生存率將僅僅只有20%。因此,明確酒精是否促進了CRC的轉移,并調查其發(fā)病機制尤其重要。趨化因子,顧名思義,是一類對細胞有趨化作用的分子蛋白;共同特點包括:分子量小(約8-10千道爾頓)、化學結構穩(wěn)定、其三級結構由四個半胱氨酸殘基組成。自1987年第一個趨化因子CXCL8(IL-8)被發(fā)現(xiàn)以來,陸續(xù)有約50種趨化因子和20多種趨化因子受體被發(fā)現(xiàn)。多種細胞如巨噬細胞、成纖維細胞、T細胞、B細胞以及腫瘤細胞本身均可分泌趨化因子;而多種細胞表面均有趨化因子受體的表達。C-C趨化因子配體5(CCL5)是趨化因子的一種,可以由T淋巴細胞、巨噬細胞、血小板、滑膜成纖維細胞、管狀的上皮細胞和某些腫瘤細胞自身分泌。CCL5在腫瘤生物學中的確切作用尚未完全闡明,CCL5可以引起適當?shù)拿庖叻磻?從而抑制腫瘤的生成;但是同時又與腫瘤的發(fā)展和轉移密切相關。目前研究表明,CCL5和其受體相互作用后,可以促進腫瘤細胞的增值、遷徙、侵襲;直接的或者間接的招募T調節(jié)細胞,抑制CD8細胞的殺傷效應形成腫瘤細胞的免疫逃逸;促進腫瘤微血管的形成和骨轉移,從而促進疾病的進展。腫瘤細胞的轉移(包括臨近器官浸潤轉移,血運和淋巴結轉移,種植轉移)是腫瘤發(fā)展的重要特征之一;腫瘤的轉移需要腫瘤細胞遷移能力的增加,并且需要能量支持。腸腫瘤細胞多為上皮來源,腫瘤細胞一旦發(fā)生上皮細胞和內皮細胞在形態(tài)學上向間充質細胞表型的轉變,遷移能力將增加,這已經(jīng)被廣泛報道。近年來越來越多的研究表明,細胞自噬和腫瘤的轉移有關。細胞自噬是一種進化上高度保守生物學進程;環(huán)境的變化或細胞內能量不足時,通過自噬相關基因和復雜信號傳導通路調控的細胞內自我消化,提供維持細胞生存所需氨基酸和脂肪酸等能量支持。自噬與腫瘤之間存在相關性,許多研究表明自噬不僅具有腫瘤抑制的功能,也可以促進腫瘤的存活。在正常組織中,自噬維持著組織的穩(wěn)態(tài);一旦自噬被抑制,組織正常的代謝被打破,將導致基因的不穩(wěn)定性、炎癥反應、和非整倍性(在減數(shù)分裂的過程中同源染色體不分離而造成的一條或多條染色體的缺失或增加)得增加,這將增高腫瘤的發(fā)生率,對腫瘤早期形成起到促進作用。但是如果自噬持續(xù)性缺失的話,腫瘤發(fā)生的進程也將被阻斷。相反的是如果在腫瘤形成后期,腫瘤的生長需要大量的能量支持,此時如果自噬被激活,則可以通過對營養(yǎng)物質的回收再利用,促進腫瘤細胞的增殖、轉移,增加其對化療藥物的抵抗作用,對腫瘤細胞起到一定的保護作用。研究表明,正常乳腺組織中,氧含量和糖原含量分別為10KP和5n M;而乳腺癌組織中為4KP和0-2n M,可見腫瘤的生存環(huán)境十分惡劣;此時一旦自噬被激活,可以為腫瘤細胞提供額外的營養(yǎng)支持,從而進一步促進腫瘤的發(fā)展的進程。本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn),酒精可以刺激多種癌癥如肺癌、肝癌、腸癌細胞的惡性生物學行為;有研究表明酒精可以引起多種細胞因子和趨化因子分泌增多。那么飲酒和腸癌疾病進展之間是否存在相關性?在飲酒的腸癌患者病程中,趨化因子CCL5起到了哪些作用?是否通過引起腸癌細胞的自噬從而參與了腫瘤轉移的調節(jié)?本課題將結合腸癌患者的飲酒病史,調查飲酒和腸癌進展之間的關系。通過調查CCL5在飲酒和非飲酒腸癌患者臨床病理標本的表達,酒精體外刺激CRC細胞株,研究酒精和CCL5表達的關系。通過人為改變CCL5表達水平,體外實驗觀察對血管內皮細胞的血管形成,觀察CCL5對CRC細胞在增殖、周期、凋亡及轉移的變化情況的影響。通過生物信息學預測以及分子實驗,驗證CCL5是否可以引起自噬;自噬增高及阻斷自噬后,對CRC細胞遷移能力的影響;并進一步調查其分子機制。探討CCL5在酒精促進的腸癌進展中的作用,為CRC的臨床治療提供新的線索。研究目的:本課題探討CCL5在飲酒的腸癌患者疾病進程中的作用,并進一步揭示其致病的分子機制。研究內容:1.選取安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2012年全年手術治療的腸癌患者病例,通過統(tǒng)計分析,調查飲酒和腸癌進展,患者術后五年生存率的關系。通過病理切片進行免疫組化,檢測CCL5在飲酒患者和非飲酒患者病理組織中的表達情況。2.RT-PCR檢測HT29、DLD-1、RKO和SW480腸癌細胞株酒精刺激前后,CCL5m RNA的表達情況。3.ELISA檢測酒精刺激前后,檢測HT29、DLD-1、RKO和SW480腸癌細胞株CCL5分泌的變化。HT29和DLD-1細胞在酒精刺激后CCL5的分泌增多,因此選取HT29和DLD-1細胞株進行后續(xù)的研究。4.血管形成實驗觀察CCL5對人臍靜脈內皮細胞的血管形成能力的影響。5.酒精慢性刺激兩周以后,RT-PCR和Western bolt檢測HT29和DLD-1細胞中CCL5表達情況;ELISA檢測CCL5分泌情況。6.給予HT29和DLD-1細胞不同濃度CCL5慢性刺激兩周,隨后:(1)MTT法檢測HT29和DLD-1細胞株的細胞增殖,并繪制生長曲線圖。(2)流式細胞儀檢測HT29和DLD-1細胞株的細胞周期。(3)Annexin V/PI法檢測HT29和DLD-細胞株的凋亡。(4)平板克隆形成實驗觀察單個細胞的體外增殖能力。(5)軟瓊脂半固體集落形成法觀察細胞獨立性非錨定生長能力。(6)Transwell法觀察細胞的遷移能力。7.CCL5慢性刺激HT29和DLD-1細胞,透射電鏡(transmission electron microscope TEM)觀察自噬體形成的情況。通過Western bolt法,檢測LC3B和p62蛋白的變化,并結合CQ阻斷自噬,檢測自噬流的情況。同時結合免疫熒光實驗,證實自噬流的存在。8.抑制自噬后,觀察CCL5引起的細胞遷移能力的增加和細胞自噬之間的關系。9.高通量測序(High-throughput sequencing)結合生物信息學技術,篩選出自噬通路中可能存在的分子通路,并通過Western blot技術進行驗證;同時通過阻斷該通路,進行反向驗證。10.阻斷該自噬信號通路,觀察CCL5引起的細胞遷移能力的增高和該自噬通路之間的關系。研究結果:1.通過對102CRC患者臨床病例分析及電話隨訪,發(fā)現(xiàn)飲酒和腫瘤的惡性程度分級,TNM分期,轉移均有相關性(P0.05);飲酒的腸癌患者術后5年生存率更低(P0.01)。2.HT29、DLD-1、RKO和SW480腸癌細胞株基礎水平均表達并分泌CCL5,酒精刺激腸癌細胞后,HT29和DLD-1細胞的CCL5分泌較基礎水平有明顯的增高(P0.05)。臨床病理切片顯示,飲酒患者癌和癌旁組織中的CCL5表達量較非飲酒患者有明顯增高(P0.05)。3.CCL5對人臍靜脈內皮細胞的血管形成能力沒有明顯的影響。4.CCL5慢性刺激HT29和DLD-1細胞兩周后,發(fā)現(xiàn)對腸癌細胞的增殖、周期、凋亡沒有明顯的影響;但是可以上調腸癌細胞的遷移能力(P0.01)。慢性酒精刺激引起HT29和DLD-1細胞遷移能力的增高,可以被CCL5Ab抵消;而敲除了酒精刺激引起的CCL5高表達的腸癌細胞,遷移能力也明顯降低。5.CCL5慢性刺激HT29和DLD-1細胞,通過TEM觀察,可以發(fā)現(xiàn)自噬體形成增多。通過Western blot、免疫熒光技術,結合自噬阻斷劑,證明了自噬流的存在并且通暢。而阻斷了自噬,腸癌細胞的遷移能力隨之下降。6.高通量測序(High-throughput sequencing)技術結合生物信息學分析結果,提示CCL5通過AMPK信號通路中的AMPK Thr172發(fā)生磷酸化,從而引起自噬。阻斷AMPK的磷酸化,不僅可以阻斷自噬,同時對CCL5引起的細胞遷移能力的增加有一定程度的抵消作用。結論:1.飲酒促進腸癌病程的進展。2.CCL5在酒精引起HT29和DLD-1細胞遷移能力上調中起到了重要的作用。3.CCL5通過AMPK通路引起自噬,從而上調HT29和DLD-1細胞的遷移能力。
【學位單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.34
【部分圖文】：

46圖 1 腸癌患者術后五年生存率和飲酒的關系。飲酒腸癌患者的術后五年生存率明顯降低。Figure 1 Survival rates of CRC patients and association of alcohol drinking. The post-op survivalrate within 5 years was shortened in CRC patients’ which with alcohol consumption.

47圖 2 酒精刺激前后，CCL5 在腸癌細胞株中，表達和分泌水平變化。a:腸癌細胞給予急性酒精刺激后，CCL5 及 CCR5 的變化；b:腸癌細胞給予急性酒精刺激后，CCL5 分泌的變化；c:酒精慢性刺激后，HT29 和 DLD-1 細胞中 CCL5 的 mRNA 和蛋白水平均有上調；d:酒精慢性刺激后，HT29 和 DLD-1 細胞分泌 CCL5 的水平較對照組有明顯增高。每組實驗獨立重復檢測三次，（*P<0.05 **P<0.01 #P>0.05 n=3）。Figure 2 Effect of EtOH on CCL5 expression and secretion in colorectal cancer cells.a-b: Colorectal cancer cells were exposed to EtOH (200 mg/dl) for indicated time. ThemRNA levels of CCL5 and CCR5 were analyzed by RT-PCR and GAPDH mRNA wasshown as a loading control. The secreted CCL5 in conditioned medium was assayed byELISA（*P<0.05）. c-d: HT29 and DLD-1cells were exposed to EtOH (200 mg/dl) for 14days. The mRNA and protein levels of CCL5 were measured by RT-PCR and Western blot.The secreted CCL5 in conditioned medium was assayed byELISA. Each data point was themean±SEM of three independent experiments and presented relative to the control values.（*P<0.05**P<0.01 #P>0.05 n=3）.

3.3 CCL5 對上皮細胞的血管形成率無明顯影響圖 3 飲酒和非飲酒腸癌患者病理標本中 CCL5 的表達 a:免疫組化顯示 CCL5 在飲酒，非飲酒的腸癌患者的癌和癌旁病理組織中的表達情況；b:統(tǒng)計學分析顯示飲酒患者癌和癌旁組織中的 CCL5 的表達均高于非飲酒患者（*P<0.05）。Figure 3 The expression of CCL5 in CRC patients’ tumor tissues whose with alcolhol consumptionor not. a: The expression of CCL5 in CRC patients’ tumor tissues was measured by IHC. b:The expression of CCL5was measured by MOD. *P<0.05

【參考文獻】

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1 Pablo Iribarren;;Chemokines and Chemokine Receptors:Their Manifold Roles in Homeostasis and Disease[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年02期

本文編號：2826276