發(fā)布時間：2020-09-22 15:57

　　 目的據(jù)2017年中國腫瘤登記年報顯示全國每天約1萬人確診為癌癥,每分鐘約7人確診患癌。死亡率排前的癌癥主要是肺癌和消化系統(tǒng)癌癥。食管癌是世界上最常見的六大惡性腫瘤之一,顯著的地域性分布差異是其流行病學的突出特征。中國是世界上食管癌發(fā)病率和病死率最高的國家,又以食管鱗癌最為常見。河南省是中國食管鱗癌的高發(fā)地區(qū),發(fā)病率高,死亡率高,嚴重威脅著人民的生命健康。食管鱗癌的相關問題厄待解決!食管鱗癌的發(fā)病原因多種多樣,它的發(fā)生機制也是錯綜復雜,有許多研究發(fā)現(xiàn)它與多種信號通路的激活有關,但其具體的發(fā)生發(fā)展機制現(xiàn)在尚不清楚。眾所周知人體的生命活動需要眾多信號通路的參與來共同調(diào)控細胞生長、細胞分化、細胞遷移、骨架重排等。據(jù)多篇研究顯示,Paks位于這些信號通路的結點處,具有多重生物學作用。Paks是p21激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,能夠被小G蛋白Rho家族中的Rac1和Cdc42所激活,具有六個家族成員。在這六個家庭成員中,Pak1和Pak4是研究最多的。據(jù)多篇研究顯示,Pak1和Pak4在許多腫瘤組織中均是高達的,并且Pak4是Paks中與人類腫瘤關系最為密切的成員,在已檢測過的100多種人類腫瘤細胞中,有多達78%的細胞高表達Pak4。人類pak4基因定位于染色體19q13.2,長度為3064bp,一共編碼591個氨基酸,其相對分子質(zhì)量為72000Da。和其他家族成員不同的是,Pak4在胚胎和成體組織中廣泛表達。它可以通過自身磷酸化、被外源性蛋白激酶磷酸化、甲基化等方式被活化。研究顯示,Pak4可參與Pak4/MEK/ERK、Pak4/PI3K/AKT/m TOR、Pak4/LIMK1/confilin等多條信號通路,從而調(diào)控腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后。多項研究顯示,Pak4在乳腺癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌等多種癌癥中均起到重要調(diào)控作用,但是Pak4在食管鱗癌中的作用及其作用機制現(xiàn)在還不清楚。本研究將通過采用人食管鱗癌組織芯片以及不同種類的人食管鱗癌細胞株,研究Pak4和p-Pak4在食管鱗癌組織和食管鱗癌細胞中的表達;通過小RNA干擾實驗和c DNA轉染實驗,研究Pak4對食管鱗癌細胞增殖,遷移和侵襲的影響;通過體內(nèi)裸鼠成瘤實驗進一步明確Pak4在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的作用,并用western blotting探討Pak4在食管鱗癌細胞增殖和侵襲中的作用機制,為Pak4作為臨床食管鱗癌患者治療的新靶標提供一定的實驗基礎和理論依據(jù)。第一部分:探討Pak4和p-Pak4在食管鱗癌組織和細胞中的表達方法1.利用免疫組織化學的方法檢測Pak4以及p-Pak4(S474)在食管鱗癌組織中的表達情況。2.利用western blotting來檢測正常食管上皮細胞和食管鱗癌細胞株中Pak4以及p-Pak4(S474)的表達情況。結果與正常食管組織和食管上皮細胞相比,Pak4和p-Pak4在食管鱗癌組織和大多數(shù)食管鱗癌細胞中均是高表達的。第二部分:探討Pak4表達降低對食管鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響方法1.構建七個包含不同pak4 sh RNA序列的PLKO.1載體。2.利用病毒感染的方法,敲低Pak4表達量相對較高的ECA109和Kyse450兩種食管鱗癌細胞株中Pak4的表達,利用western blotting鑒定穩(wěn)轉株中Pak4的敲低效率。3.利用細胞增殖實驗來探討Pak4表達降低后,食管鱗癌細胞增殖能力的變化。4.利用軟瓊脂克隆形成實驗來研究Pak4表達降低后,食管鱗癌細胞克隆形成能力的變化。5.利用細胞劃痕實驗來探討Pak4表達降低后,食管鱗癌細胞遷移能力的變化。6.利用Transwell侵襲實驗來證明Pak4表達降低后,食管鱗癌細胞侵襲能力的變化。結果Pak4參與食管鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程,Pak4表達降低會抑制食管鱗癌細胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移能力和侵襲能力。第三部分:探討Pak4表達升高對食管鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響方法1.利用轉染的方法把pak4的c DNA轉染進Pak4表達量相對較低的Kyse30和Kyse150兩種食管鱗癌細胞株中,再次利用western blotting鑒定Pak4過表達穩(wěn)轉株是否建立成功。2.利用細胞增殖實驗來探討Pak4表達增加后,食管鱗癌細胞增殖能力的變化。3.利用軟瓊脂克隆形成實驗來研究Pak4表達增加后,食管鱗癌細胞克隆形成能力的變化。4.利用細胞劃痕實驗來探討Pak4表達增加后,食管鱗癌細胞遷移能力的變化。5.利用Transwell侵襲實驗來證明Pak4表達增加后,食管鱗癌細胞侵襲能力的變化。結果Pak4表達增加,食管鱗癌細胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移能力和侵襲能力均增高,Pak4參與食管鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程。第四部分:用體內(nèi)實驗驗證Pak4在食管鱗癌中的作用方法根據(jù)前期實驗結果,選擇ECA109-shmock、ECA109-shpak4-1和ECA109-shpak4-2三種穩(wěn)轉細胞株進行裸鼠成瘤實驗,觀察Pak4降低后,裸鼠瘤重和瘤體積的變化。結果ECA109-shmock的成瘤時間為4天,ECA109-shpak4-1和ECA109-shpak4-2的成瘤時間分別為9天和6天;與ECA109-shmock相比,ECA109-shpak4-1和ECA109-shpak4-2的瘤重小,瘤體積也小,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。第五部分:探討Pak4影響食管鱗癌增殖和侵襲的作用機制方法用western blotting實驗來初步探討Pak4影響食管鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用機制。結果Pak4通過參與ERK,AKT和EMT信號通路影響食管鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲。結論1.相比較正常食管組織和正常食管上皮細胞,Pak4和p-Pak4在食管鱗癌組織和食管鱗癌細胞中均是高表達的。2.Pak4促進食管鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲,其作用可能是通過ERK、AKT和EMT信號通路的調(diào)控實現(xiàn)的。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.1
【部分圖文】：

17圖 1.1 Pak4 及 p-Pak4 在食管組織中的表達情況及結果分析比例尺為 50μm，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。2 Pak4 以及 p-Pak4 在食管鱗癌細胞株中是高表達的將收集的細胞從-80℃冰箱中取出冰上溶解，加入適量裂解液提取蛋 Western blotting 驗證不同來源的食管鱗癌細胞株中 Pak4 及 p-Pak4 的表達

Westernblotting檢測不同來源的食管鱗癌細胞株中Pak4及p-Pak4（S474）的表

3 實驗結果3.1 PLKO.1-shpak4 載體的構建選用 PLKO.1 作為載體，在載體上連接 pak4 的 shRNA 序列，連接成功后對構建的載體進行酶切鑒定和測序鑒定。結果如圖 2.1 所示，7 個序列在酶切之后均出現(xiàn)了 2kb 和 5kb 兩個片段，說明 shRNA 序列連接的位置是正確的。測序結果（僅呈現(xiàn)其中兩個序列）顯示構建的載體中包含著 pak4 的 shRNA 序列，說明連接的順序是正確的。由酶切鑒定和測序鑒定的結果可知，PLKO.1-shpak4 載體構建成功。

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 云揚;陳潔;陳飛飛;;Pak4的生物學特性及其與腫瘤的相關性研究[J];亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥;2011年09期

2 ;Angiopoietin-1 targeted RNA interference suppresses angiogenesis and tumor growth of esophageal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2008年10期

本文編號：2824604