實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有賴于新生血管的形成,因此通過(guò)抗腫瘤血管生成抑制腫瘤的進(jìn)展成為醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)。近來(lái)研究表明,以血管生成相關(guān)抗原為靶點(diǎn)的疫苗可以引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng),通過(guò)抑制新生血管的生成,起到阻止腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。其中,以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)作為抗原制備的全細(xì)胞疫苗抗腫瘤血管生成的研究發(fā)現(xiàn),該疫苗雖能引起一定程度的免疫應(yīng)答,但治療效果仍然較為有限,有必要對(duì)該疫苗進(jìn)一步優(yōu)化。腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞在生長(zhǎng)因子受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及黏附分子等方面有顯著差異。我們?cè)O(shè)想體外模仿腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)HUVEC,使其接近腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特性,用誘導(dǎo)后的HUVEC作為疫苗可能比HUVEC疫苗產(chǎn)生更好的抑制腫瘤血管生成的效果。查閱文獻(xiàn)后,該方面研究尚未見報(bào)道。課題組前期已建立了體外采用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清模擬腫瘤微環(huán)境的方法,本研究采用小鼠結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞培養(yǎng)上清液模擬腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)HUVEC,誘導(dǎo)后的HUVEC均高表達(dá)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物,遷移和侵襲能力增強(qiáng),與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特性相似,故稱誘導(dǎo)后的HUVEC為腫瘤化HUVEC。機(jī)體對(duì)自身或同種異體的抗原存在免疫耐受的情況,但異種疫苗可打破機(jī)體對(duì)自身抗原的免疫耐受,易被宿主機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別并加以排斥。用腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞接種小鼠,可打破免疫耐受并誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗血管生成免疫應(yīng)答,破壞腫瘤新生血管,抑制腫瘤生長(zhǎng)。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞,它能夠攝取腫瘤抗原,誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T-lymphocytes,CTL)介導(dǎo)強(qiáng)大的特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)。目前DC疫苗種類繁多,本實(shí)驗(yàn)采用小鼠骨髓來(lái)源的DC負(fù)載CT26細(xì)胞凍融抗原,即DC-CT26疫苗。該疫苗攜帶全部的腫瘤抗原,無(wú)需分離特異的抗原肽,無(wú)需確定MHC的單元型和MHC限制性的抗原決定簇,通過(guò)誘導(dǎo)CTL免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗腫瘤作用。結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)第四大導(dǎo)致死亡的癌癥,每年有超過(guò)120萬(wàn)名新診斷的病人和60余萬(wàn)人死于該病,2017年國(guó)家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示,在中國(guó)它的發(fā)病率和死亡率都排在第五位。早期結(jié)直腸癌無(wú)癥狀,通常要到晚期才能被診斷出來(lái),結(jié)直腸癌的5年生存率不到10%,因此迫切需要制定新的策略來(lái)治療結(jié)直腸癌。本研究采用小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞上清誘導(dǎo)HUVEC,制備腫瘤化HUVEC疫苗,主要通過(guò)激活體液免疫發(fā)揮抗腫瘤血管生成作用;制備負(fù)載CT26細(xì)胞凍融抗原的DC-CT26疫苗,其主要通過(guò)激活細(xì)胞免疫殺傷結(jié)直腸癌細(xì)胞。兩種疫苗聯(lián)合應(yīng)用一方面產(chǎn)生抗結(jié)直腸癌血管內(nèi)皮細(xì)胞效應(yīng),另一方面產(chǎn)生抗結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用,以提高抗結(jié)直腸癌效果。第一部分腫瘤化HUVEC疫苗抗小鼠結(jié)直腸癌血管生成的作用材料與方法1.采用小鼠結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞培養(yǎng)上清模擬腫瘤微環(huán)境,通過(guò)劃痕、侵襲實(shí)驗(yàn)和Western blot等方法檢測(cè)腫瘤微環(huán)境對(duì)HUVEC的影響。2.腫瘤化HUVEC疫苗:(1)收CT26細(xì)胞上清:CT26細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度約80%時(shí),換5ml/dish含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,24h后收集培養(yǎng)液,3000r/min離心5min,收集上清,-20℃保存?zhèn)溆谩?2)制備腫瘤化HUVEC疫苗:HUVEC常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度約60%時(shí)換條件培養(yǎng)基,加入量10ml/dish,培養(yǎng)48h,即為腫瘤化HUVEC。培養(yǎng)48h后,HUVEC消化、離心棄上清后加入0.025%戊二醛,混勻后4℃避光固定20min,PBS重懸調(diào)濃度至2.5×10~7/ml,-80℃保存?zhèn)溆谩?.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組:將SPF級(jí)4-6周齡、雌性BALB/c小鼠21只(20-22g)飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)中,隨機(jī)分成PBS組、HUVEC組和Induced HUVEC組,每組7只,在小鼠腋窩淋巴結(jié)周圍接種疫苗,PBS組:每只注射0.2ml的PBS作為空白對(duì)照,1次/周,共5周;HUVEC組:每只注射0.2ml HUVEC疫苗(2.5×10~7/ml),1次/周,共5周;Induced HUVEC組:每只注射0.2ml腫瘤化的HUVEC疫苗(2.5×10~7/ml),1次/周,共5周。接種結(jié)束后的第7天,對(duì)各組小鼠進(jìn)行背部皮下注射CT26細(xì)胞(1×10~5個(gè)/只)。接種CT26細(xì)胞后第11天起,隔天測(cè)量瘤體并觀察瘤體生長(zhǎng)及小鼠存活情況,第24天,眼眶取血后拉頸處死小鼠。4.腫瘤標(biāo)本的處理:收集腫瘤組織稱重并拍照,一部分腫瘤組織用10%中性甲醛固定后石蠟包埋,常規(guī)制片,用于免疫組化;另一部分-80℃保存,用于血紅蛋白和Western blot實(shí)驗(yàn)。5.免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中CD31的表達(dá),判定腫瘤組織血管生成情況。血紅蛋白實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤組織研磨物上清中血紅蛋白的濃度,間接反映腫瘤血管生成情況。Western blot檢測(cè)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(TEM1、TEM8和VEGFR2),判定腫瘤組織中血管生成情況。6.提取各組小鼠的血清做一抗,孵育腫瘤化HUVEC總蛋白,通過(guò)Western blot檢測(cè)小鼠血清中產(chǎn)生的增殖相關(guān)抗體表達(dá)水平。ELISA檢測(cè)各組小鼠血清中HUVEC抗體產(chǎn)生的情況。結(jié)果1.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組和40%CT26細(xì)胞上清誘導(dǎo)組相比,60%CT26細(xì)胞上清誘導(dǎo)組的內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)最多(P0.001,P0.001)。2.侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組和40%CT26細(xì)胞上清誘導(dǎo)組相比,60%CT26細(xì)胞上清誘導(dǎo)組的內(nèi)皮細(xì)胞侵襲數(shù)最多(P0.001,P0.001)。3.Western blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,60%CT26細(xì)胞上清誘導(dǎo)組的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物TEM1、TEM8、VEGFR2表達(dá)明顯增高(P0.001)。4.各組小鼠腫瘤體積和重量結(jié)果顯示:與PBS組和HUVEC組相比,Induced HUVEC組的小鼠腫瘤體積最小(P0.001,P0.05)和重量最輕(P0.001,P0.05)。5.免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與PBS組和HUVEC組相比,Induced HUVEC組腫瘤組織微血管密度最少(P0.001,P0.01);血紅蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與PBS組和HUVEC組相比,Induced HUVEC組腫瘤組織中血紅蛋白含量最少(P0.001,P0.01)。Western blot結(jié)果顯示:與PBS組和HUVEC組相比,Induced HUVEC組腫瘤組織中血管內(nèi)皮標(biāo)志物TEM1、TEM8、VEGFR2表達(dá)明顯減低(P0.001,P0.01)。6.Western blot初步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在分子量為165kD、130kD、63kD處出現(xiàn)陽(yáng)性條帶,與購(gòu)買的TEM1、VEGFR2和TEM8一抗孵育腫瘤化HUVEC總蛋白后產(chǎn)生的目的條帶分子量一致,初步推斷分子量為165kD的條帶可能為TEM1,分子量為130kD的條帶可能為VEGFR2,分子量為63kD的條帶可能為TEM8。7.ELISA結(jié)果顯示:與PBS組和HUVEC組相比,Induced HUVEC組小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的HUVEC抗體效價(jià)最高(P0.001,P0.01)。第二部分腫瘤化HUVEC疫苗聯(lián)合DC-CT26疫苗抗小鼠結(jié)直腸癌移植瘤的作用材料與方法1.DC-CT26疫苗制備:反復(fù)凍融法獲得CT26細(xì)胞抗原,測(cè)CT26細(xì)胞裂解物的濃度后,-80℃保存?zhèn)溆�。小鼠骨髓源DC培養(yǎng)第5天,加入CT26細(xì)胞裂解物(100μg/ml),培養(yǎng)至第8天,胰酶消化收獲DC,即得到DC-CT26疫苗,PBS重懸調(diào)整濃度至5×10~6/ml。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組:將SPF級(jí)4-6周齡、雌性BALB/c小鼠140只(20-22g左右)飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)中,隨機(jī)分成PBS組、DC-CT26組、Induced HUVEC組和Combined group組,每組8只,在小鼠腋窩淋巴結(jié)周圍接種相應(yīng)的疫苗。PBS組:每只注射0.2ml的PBS作為空白對(duì)照;1次/周,共5周;DC-CT26組:每只注射0.2ml所制備DC-CT26疫苗(5×10~6/ml),1次/周,共5周;Induced HUVEC組:每只注射0.2ml誘導(dǎo)的HUVEC疫苗(2.5×10~7/ml),1次/周,共5周;Combined group組,一側(cè)腋窩淋巴結(jié)周圍注射0.2ml所制備DC-CT26疫苗(5×10~6/ml),另一側(cè)腋窩淋巴結(jié)周圍注射0.2ml所制備Induced HUVEC疫苗(2.5×10~7/ml),1次/周,共5周。3.同樣方法注射CT26細(xì)胞后第10天起,隔天測(cè)量瘤體并觀察瘤體生長(zhǎng)及小鼠存活情況;第28天,眼眶取血后處死所有小鼠,收集腫瘤組織稱重并拍照。利用免疫組化、血紅蛋白實(shí)驗(yàn)、Western blot和ELISA檢測(cè)腫瘤組織新生血管的情況以及小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞抗體。4.剝離各組小鼠脾臟組織,稱重并拍照,計(jì)算脾臟指數(shù)檢測(cè)機(jī)體的免疫功能;按照Cyto Tox96~?非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,檢測(cè)小鼠體內(nèi)CTL對(duì)CT26細(xì)胞的殺傷作用;按照小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,檢測(cè)小鼠血清中IFN-γ的含量;從小鼠脾臟組織中分離得到淋巴細(xì)胞;通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠脾臟組織中CD3~+、CD8~+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果1.各組小鼠腫瘤體積和重量結(jié)果顯示:與PBS組相比,DC-CT26組、Induced HUVEC組和Combined group組小鼠腫瘤體積明顯減少(P0.05,P0.01,P0.01),小鼠重量明顯降低(P0.05,P0.001,P0.001),并且Combined group組小鼠腫瘤體積明顯低于DC-CT26組和Induced HUVEC組(P0.01,P0.05),小鼠重量也明顯低于DC-CT26組和Induced HUVEC組(P0.05,P0.05)。抑瘤率結(jié)果顯示:Combined group組的抑瘤率強(qiáng)于DC-CT26組和Induced HUVEC組相(P0.001,P0.05)。2.免疫組化結(jié)果顯示:與PBS組相比,Induced HUVEC組和Combined group組腫瘤組織微血管密度明顯減少(P0.001,P0.001),并且Combined group組腫瘤組織微血管密度明顯少于DC-CT26組和Induced HUVEC組(P0.001,P0.01)。血紅蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與PBS組相比,DC-CT26組、Induced HUVEC組和Combined group組腫瘤組織中血紅蛋白含量明顯減少(P0.001,P0.001,P0.001),并且Combined group組腫瘤組織中血紅蛋白含量低于DC-CT26組和Induced HUVEC組(P0.001,P0.01)。Western blot結(jié)果顯示:與PBS組相比,Induced HUVEC組和Combined group組中腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物TEM1、TEM8、VEGFR2表達(dá)明顯降低(P0.001,P0.001),并且Combined group組中腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物TEM1、TEM8、VEGFR2表達(dá)明顯低于DC-CT26組和Induced HUVEC組(P0.001,P0.01);3.Western blot初步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在分子量為165kD、130kD、63kD處出現(xiàn)陽(yáng)性條帶,與購(gòu)買的TEM1、VEGFR2和TEM8一抗孵育腫瘤化HUVEC總蛋白后產(chǎn)生的目的條帶分子量一致,初步推斷分子量為165kD的條帶可能為TEM1,分子量為130kD的條帶可能為VEGFR2,分子量為63kD的條帶可能為TEM8。4.ELISA結(jié)果顯示:Induced HUVEC組和Combined group組小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的HUVEC抗體效價(jià)高于PBS組(P0.01,P0.01),并且Combined group組小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的HUVEC抗體效價(jià)高于DC-CT26組和Induced HUVEC組(P0.01,P0.05)。5.各組小鼠脾臟組織重量結(jié)果顯示:與PBS組相比,DC-CT26組、Induced HUVEC組和Combined group組小鼠脾臟組織重量明顯增高(P0.001,P0.001,P0.001),并且Combined group組小鼠脾臟組織重量高于DC-CT26組和Induced HUVEC組(P0.05,P0.05);脾臟指數(shù)顯示DC-CT26組、Induced HUVEC組和Combined group組小鼠脾臟指數(shù)高于PBS組(P0.01,P0.05,P0.001),并且Combined group組小鼠脾臟指數(shù)高于DC-CT26組、Induced HUVEC組(P0.01,P0.01)。6.殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與PBS組相比,DC-CT26組、Induced HUVEC組和Combined group組小鼠體內(nèi)CTL對(duì)CT26細(xì)胞的殺傷效果增強(qiáng)(P0.001,P0.01,P0.001),并且Combined group組小鼠體內(nèi)CTL對(duì)CT26細(xì)胞的殺傷效果強(qiáng)于DC-CT26組和Induced HUVEC組(P0.001,P0.001)。7.ELISA結(jié)果顯示:與PBS組相比,DC-CT26組、Induced HUVEC組和Combined group組小鼠體內(nèi)的IFN-γ的含量增高(P0.001,P0.001,P0.001),并且Combined group組小鼠體內(nèi)的IFN-γ的含量高于DC-CT26組和Induced HUVEC組相(P0.001,P0.001)。8.流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與PBS組相比,DC-CT26組和Combined group組小鼠脾臟組織內(nèi)CD3~+CD8~+T淋巴細(xì)胞的含量增高(P0.01,P0.001),并且Combined group組小鼠脾臟組織內(nèi)CD3~+、CD8~+T淋巴細(xì)胞的含量高于DC-CT26組和Induced HUVEC組(P0.001,P0.001)。結(jié)論1.腫瘤化HUVEC疫苗抑制小鼠結(jié)直腸瘤效果優(yōu)于HUVEC疫苗。2.腫瘤化HUVEC疫苗和DC-CT26疫苗的聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)應(yīng)用具有更好的抑瘤效果。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.34
【部分圖文】：

圖 1. CT26 上清對(duì) HUVEC 遷移和侵襲能力的影響. 通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)不同濃度的 CT26上清在誘導(dǎo) HUVEC 24h 和 48h 時(shí) HUVEC 遷移的細(xì)胞數(shù)；通過(guò)侵襲實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)不同濃度的CT26 上清在誘導(dǎo) HUVEC 24h 時(shí) HUVEC 侵襲的細(xì)胞數(shù)。每組數(shù)據(jù)均重復(fù)三次。A.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè) HUVEC 的遷移能力（scale bar，50μm）；B.侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè) HUVEC 的侵襲能力（scalebar，50μm）（***P＜0.001）。3.1.2 腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)后 HUVEC 表達(dá)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的情況HUVEC 是體外培養(yǎng)并處于增殖狀態(tài)的內(nèi)皮細(xì)胞，攜帶有與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞相同的增殖相關(guān)抗原，但其與腫瘤微環(huán)境下的血管內(nèi)皮細(xì)胞仍有較大差異。通過(guò) Western blot 檢測(cè)腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)后的 HUVEC 腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物（TEM1、TEM8 和 VEGFR2）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，60%CT26 上清誘導(dǎo) HUVEC48h 后，HUVEC 高表達(dá)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物（P＜0.001）（圖 2）。

1. CT26 上清對(duì) HUVEC 遷移和侵襲能力的影響. 通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)不同濃度的 C清在誘導(dǎo) HUVEC 24h 和 48h 時(shí) HUVEC 遷移的細(xì)胞數(shù)；通過(guò)侵襲實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)不同濃T26 上清在誘導(dǎo) HUVEC 24h 時(shí) HUVEC 侵襲的細(xì)胞數(shù)。每組數(shù)據(jù)均重復(fù)三次。A.劃?rùn)z測(cè) HUVEC 的遷移能力（scale bar，50μm）；B.侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè) HUVEC 的侵襲能力（ar，50μm）（***P＜0.001）。.1.2 腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)后 HUVEC 表達(dá)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的情況HUVEC 是體外培養(yǎng)并處于增殖狀態(tài)的內(nèi)皮細(xì)胞，攜帶有與腫瘤血管內(nèi)皮相同的增殖相關(guān)抗原，但其與腫瘤微環(huán)境下的血管內(nèi)皮細(xì)胞仍有較大差異過(guò) Western blot 檢測(cè)腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)后的 HUVEC 腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志TEM1、TEM8 和 VEGFR2）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，60%CT26 上清誘導(dǎo) HUV8h 后，HUVEC 高表達(dá)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物（P＜0.001）（圖 2）。

26圖3. 60%去激素的結(jié)直腸癌細(xì)胞上清的HUVEC的影響. 通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)60%去激素的結(jié)直腸癌細(xì)胞上清在誘導(dǎo) HUVEC 24h 和 48h 時(shí) HUVEC 遷移的細(xì)胞數(shù)；通過(guò)侵襲實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)60%去激素的結(jié)直腸癌細(xì)胞上清在誘導(dǎo) HUVEC 24h 時(shí) HUVEC 侵襲的細(xì)胞數(shù)；通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)。每組數(shù)據(jù)均重復(fù) 3 次每組數(shù)據(jù)均重復(fù)三次。A. 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè) HUVEC 的遷移能力（scale bar，80μm）；B. 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè) HUVEC的侵襲能力（scale bar，40μm）；C. RT-qPCR 檢測(cè)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物 TEM1、TEM8 和 VEGFR2 mRNA 的表達(dá)（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2821395