研究背景惡性胸腔積液是指原發(fā)于胸膜的惡性腫瘤或其他部位的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至胸膜腔引起的積液。肺癌是發(fā)生惡性胸腔積液最常見的原因。出現(xiàn)惡性胸腔積液表明腫瘤播散或已進展至晚期,患者預期壽命將顯著縮短。惡性胸腔積液導致的呼吸困難、乏力等癥狀嚴重降低患者的生活質(zhì)量。目前對于惡性胸腔積液的治療主要集中在以緩解呼吸困難癥狀為目的的治療性胸腔穿刺術、胸膜固定術或肋間埋管間斷引流胸腔積液等措施,但這些治療手段療效不佳,患者復發(fā)率較高。其主要原因是目前惡性胸腔積液的形成機制不清。材料和方法通過流式細胞術分析臨床初診晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者血清及配對胸腔積液上清中外泌體標本細胞程式死亡-配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)水平,明確 PD-L1 和預后的關系,明確血清和配對胸腔積液外泌體上PD-L1的一致性。分析不同熒光強度PD-L1水平的胸腔積液中常見免疫細胞的數(shù)量。2.構建胸腔積液動物模型,基于動物模型基礎上探討胸腔內(nèi)腫瘤來源外泌體(tumor-derived exosomes,TEX)和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)胸腔內(nèi)注射后對胸腔積液形成的影響,通過CD31染色、RNA轉(zhuǎn)錄組測序等明確TEX在促進胸腔積液形成過程中的初步機制。3.在胸腔積液動物模型基礎上,收集外泌體處理和PBS處理過的腫瘤組織、消化、研磨獲取細胞懸液,流式細胞術檢測CD4+T細胞,CD8+T細胞、B淋巴細胞,巨噬細胞,樹突狀細胞,嗜中性粒細胞,自然殺傷細胞的比例并進行比較。從小鼠中取出新鮮脾臟,研磨制成單細胞懸液,分選CD8+T細胞,加入TEX和PBS,共孵育并收集細胞進行流式分析。檢測腫瘤殺傷能力。免疫細胞缺陷的裸鼠體內(nèi)重復相同的實驗,確認TEX促進胸腔積液形成是否與改變免疫細胞比例有關。4.檢測,TEX上的PD-L1的水平。將高表達PD-L1的TEX加入到正常C57BL/6小鼠來源的CD8+ T細胞中,檢測其增殖能力。將抗PD-L1抗體和對照抗體與TEX孵育,再將TEX吸附至乳膠微粒進行流式分析,確認抗體的阻斷效果。之后將對照抗體和抗PD-L1抗體孵育后的TEX加入到小鼠來源的經(jīng)活化的免疫細胞中,收集細胞進行流式分析。5.將TEX與抗PD-L1抗體孵育后,流式檢測TEX上PD-L1的水平,確定抗體的阻斷效果。將抗PD-L1抗體加入到PBS或TEX中孵育,再將其加入到體外培養(yǎng)的免疫細胞中。檢測免疫細胞的體外殺傷腫瘤能力和體外增殖能力,明確其對免疫細胞的抑制作用。將阻斷PD-L1的TEX打入小鼠胸腔內(nèi),分析成瘤后胸腔積液中免疫細胞的數(shù)量及胸腔積液的形成。實驗結果1.66例患者血清外泌體流式檢測發(fā)現(xiàn),所有患者外泌體均存在不同程度的PD-L1,流式細胞顯示平均熒光強度范圍23.5-308,而25例健康對照組血清外泌體PD-L1平均熒光強度范圍5.1-15.2,兩組PD-L1水平有顯著統(tǒng)計學差異(P0.001)。配對胸腔積液檢測發(fā)現(xiàn),胸腔積液中PD-L1也同樣存在高表達情況,與血清外泌體上PD-L1表達存在正相關。而良性胸腔積液中外泌體上PD-L1水平較惡性胸腔積液顯著降低,同時分析發(fā)現(xiàn),PD-L1高的胸腔積液和低的胸腔積液上存在CD8+T細胞數(shù)量的差異,PD-L1高的胸腔積液中CD8+T細胞比例低。進一步分析發(fā)現(xiàn)血清PD-L1水平高的患者,其預后較差,這提示外泌體上PD-L1可能通過某種途徑促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。2.將LLC細胞注射入小鼠胸腔內(nèi),同期分別給予30ug/50uLTEX和等量的PBS連續(xù)三次腔內(nèi)注射。第5天和14天活體成像結果顯示TEX組的小鼠胸腔內(nèi)的腫瘤成像強度明顯強于PBS組。第14天將小鼠處死后打開胸腔,與PBS組相比,TEX組出現(xiàn)更多的肉眼可見的腫瘤組織,胸水的體積也更多。處死前尾靜脈注射伊文思藍(Evans'blue)溶液至小鼠體內(nèi),TEX組的胸水中的Evans'blue的量多于PBS組,證明TEX組的小鼠胸腔的血管滲透能力更強,這有利于胸水形成。這些結果說明TEX的胸腔注射能明顯促進胸腔腫瘤的生長和胸水的生成。3.將成瘤后14天的小鼠的腫瘤組織及胸膜取出,切片后對組織切片進行CD31的免疫組化及免疫熒光染色。結果顯示,TEX組的腫瘤內(nèi)血管數(shù)量明顯多于PBS組,TEX組的胸膜組織的血管標記物CD31的表達也強于PBS組。同時胸膜mRNA轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)及IL-6表達在TEX組也較PBS組顯著升高,這些指標被證實和免疫抑制密切相關。4.流式分析腫瘤組織細胞懸液發(fā)現(xiàn),與PBS組相比,TEX組內(nèi)胸膜腔腫瘤細胞懸液的CD8+T細胞的數(shù)量顯著下降,而中性粒細胞、CD4+T細胞、NK細胞、巨噬細胞和B細胞的數(shù)量沒有顯著差異。進一步分析發(fā)現(xiàn)TEX還抑制CD8+ T細胞的活化標志物CD69和interferony IFN-γ)的表達。TEX組來源的CD8+T細胞的腫瘤殺傷能力也明顯弱于PBS組。5.T細胞缺陷的裸鼠體內(nèi)進行了相同的實驗,結果發(fā)現(xiàn)在裸鼠體內(nèi)TEX并不能促進胸腔腫瘤的生長。胸水體積以及胸水內(nèi)Evans' blue的量在PBS和TEX兩組之間沒有明顯差異。6.檢測了 TEX上的PD-L1的表達。流式分析顯示TEX上有豐富的PD-L1表達。將高表達PD-L1的TEX加入到正常C57BL/6小鼠來源的CD8+ T細胞中,結果顯示,TEX處理的CD8+T細胞的增殖能力明顯減弱。7.將抗PD-L1抗體加入到PBS或TEX中孵育,再將其加入到體外培養(yǎng)的CD8+T細胞中。結果顯示,阻斷PD-L1之后TEX對CD8+ T細胞的抑制作用消失。體內(nèi)實驗中,阻斷PD-L1的TEX打入小鼠胸腔內(nèi),結果顯示,阻斷PD-L1之后TEX不再抑制CD8+ T細胞的數(shù)量。小鼠胸腔內(nèi)注射PD-L1抗體阻斷的TEX,結果顯示,TEX無法促進胸腔腫瘤的生長及胸腔積液的增加。結論1.腫瘤患者血清和配對胸腔積液中外泌體中普遍存在PD-L1表達,表達水平越高的患者預后越差,提示外泌體上PD-L1表達可以作為預后標志物。血清和配對胸腔積液中PD-L1表達有一定的相關性。同時,高表達PD-L1的胸腔積液中CD8+T比例偏低。2.動物實驗發(fā)現(xiàn),TEX能夠促進胸腔積液的形成,其作用和TEX能夠促進胸膜血管通透性增加有一定的關系。3.進一步研究發(fā)現(xiàn),TEX上PD-L1表達水平比較高的患者CD8+ T細胞的增殖能力明顯減弱,TEX高表達PD-L1能體外抑制CD8+T細胞的增殖并降低其殺傷能力。4.通過抗PD-L1藥物干預發(fā)現(xiàn),TEX介導的促腫瘤作用依賴于PD-L1,外泌體上的PD-L1表達通過降低CD8+ T細胞比例最終促進了胸腔積液的產(chǎn)生。
【學位單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R730.2
【部分圖文】：

圖１：血清中外泌體透射電鏡技術檢測（圖Ａ：放大６００００倍；圖Ｂ：９００００明確的脂質(zhì)雙層結構，大小在５０－１５０ｎｍ之間．符合典型外泌體特征。Ｗｅｓｔｅ提取物高表達ＣＤ６３和ＴＳＧ１０１．而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成有關的蛋白ＧＲＰ９４不存一步說明我們所離心獲取的提取物是內(nèi)體來源．句內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無關；這表明．外泌體（圖Ｃ）。逡逑３．２．患者及健康對照人群一般特征逡逑我們共獲�。叮独砥诜切〖毎伟┗颊叩难澹玻道】祵φ胀砥诜伟┗颊咧�，男性４１例，女性２５例，中位年齡５８歲，其中例，３１例為既往或正在吸煙。其中３７例患者體能狀況評分為１分。腺癌患者占比最高，共５８例患者。其中發(fā)生胸腔積液轉(zhuǎn)移的有胸腔積液轉(zhuǎn)移的患者５１例。所有患者均未接受過放療、化療

圖３：腫瘤來源外泌體和健康人群的外泌體進行流式檢測ＰＤ－Ｌｌ，結果顯示，腫瘤來體上ＰＤ－Ｌ１較健康人群顯著升高，中位值分別為９０．０和９．２邋（Ｐ＜０．００１）（圖Ａ）。ｂｌｏｔ分析顯示，ＰＤ－Ｌ１蛋白表達在腫瘤來源外泌體上高表達，而在健康人外泌體上低表Ｂ）邋0逡逑３．４氋與低ＰＤ－Ｌ１表達患者的臨床特征差異逡逑我們以６６例患者的ＰＤ－Ｌ１表達比例的中位值為ｃｕｔ－ｏｆｆ值（中位ＭＦＩ值為將６６例患者分為兩組，其中高表達組為３３人，低表達組為３３人。兩組一般特征見表２．逡逑比較發(fā)現(xiàn)，高水平ＰＤ－Ｌ１組的患者ＩＶｂ患者比例偏高，這提示腫瘤負荷和位多少可能影響患者的ＰＤ－Ｌ１水平，腫瘤轉(zhuǎn)移越廣泛，其外泌體ＰＤ－Ｌ１

圖４：以ＭＦＩ＝９０為分界．結果顯示，高ＭＦＩ組無論ＰＦＳ邋（圖Ａ）還是ＯＳ均顯著降低（Ｂ）邋0逡逑３．６邋ＰＤ－Ｌ１邋＾＾檢測逡逑我們對１２例患者進行了動態(tài)檢測，獲取了邋１２例患者治療兩周期后的外泌體并行ＰＤ－Ｌ１檢測，結果發(fā)現(xiàn)，總體上來講，兩周期后ＰＤ－Ｌ１水平顯著降低。但３例患者上升，其中上升組的３例患者的療效為２例進展（ＰＤ），邋１例為穩(wěn)定（ＳＤ）而降低組患者的療效為６例部分緩解（ＰＲ），３例穩(wěn)定（ＳＤ），未見進展（ＰＤ患者。逡逑３．７配對胸腔積液ＰＤ－Ｌ１表達及免疫細胞分析逡逑６６例患者中，其中１５例患者初診時存在胸腔積液，我們獲取了邋１１例患者的腔積液，對胸腔積液上清進行超離獲取外泌體，同時獲�。忱悄[瘤患者的胸

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