目的 探究miR-20b在肝癌中表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。明確miR-20b在HepG2細(xì)胞中的生物學(xué)功能,分析并驗(yàn)證其發(fā)揮作用的直接靶基因,探索其HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的可能分子機(jī)制。方法 1、收集76例肝癌組織標(biāo)本并且選擇76例正常肝臟組織作為對(duì)照,運(yùn)用RT-PCR分別檢測(cè)兩組miR-20b的表達(dá)水平。2、根據(jù)miR-20b在肝癌組織中的表達(dá)水平,將HCC患者分為miR-20b高表達(dá)組和低表達(dá)組,進(jìn)而分析miR-20b表達(dá)量與HCC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系。3、利用生物學(xué)數(shù)據(jù)庫檢索miR-20b可能的靶基因,并通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、Westernblot等技術(shù)鑒定miR-20b對(duì)其靶基因的調(diào)控。4、通過體外轉(zhuǎn)染miR-20b mimic和inhibitor及siRNA-HIF-1α、siRNA-VEGF的方法,以MTT、流式細(xì)胞凋亡等檢測(cè)miR-20b對(duì)HepG2細(xì)胞增殖與凋亡的影響。結(jié)果 1、分別檢測(cè)了76例肝癌組織及正常肝臟組織中miR-20b的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在大部分肝癌組織中miR-20b表達(dá)水平明顯增高,差異有顯著性。2、MiR-20b表達(dá)水平與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分級(jí)無關(guān),但與腫瘤轉(zhuǎn)移(P=0.00)、TNM分期(P=0.00)及腫瘤復(fù)發(fā)(P=0.023)密切相關(guān), miR-20b的高表達(dá)與肝癌患者的短總體生存期相關(guān),提示miR-20b可以作為一個(gè)判斷肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。3、構(gòu)建HIF-1α、VEGF3'-UTR pGL3cm野生型及突變型熒光素酶報(bào)告載體和pCDH-miR-20b質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后。結(jié)果顯示,miR-20bb可以顯著下調(diào)含有HIF-1α、VEGF靶基因3’-UTR的熒光素酶報(bào)告基因pGL3-3'-UTR的活性,而對(duì)含突變位點(diǎn)的表達(dá)質(zhì)粒對(duì)熒光素酶活性無明顯改變。表明miR-20b對(duì)HIF-1α、VEGF3'-UTR有直接負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。4、MiR-20b與HIF-1α、VEGF在HepG2細(xì)胞正�；蚰M低氧條件表達(dá)水平呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。在常氧條件下,miR-20b的表達(dá)與低氧組(低氧組細(xì)胞使用300μmol/L CoCl2處理細(xì)胞24h)相比明顯增高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低氧條件下VEGF的mRNA表達(dá)水平與常氧組相比明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HIF-1α的mRNA表達(dá)水平增加并不明顯。5、MiR-20b的高表達(dá)能夠明顯增加HepG2細(xì)胞的增殖能力。當(dāng)抑制miR-20b細(xì)胞增殖能力下降。同時(shí)沉默HIF-la、VEGF功能后細(xì)胞增殖能力隨之增強(qiáng)。HIF-la、VEGF在常氧環(huán)境中對(duì)于細(xì)胞增殖起著決定性作用。6、在常氧環(huán)境下細(xì)胞抑制miR-20b能夠明顯的降低細(xì)胞凋亡比率。同時(shí)沉默HIF-la、 VEGF功能后細(xì)胞凋亡比率明顯增加。低氧環(huán)境下細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-20b-mimics后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡明顯增加,HIF-1α、VEGF的表達(dá)對(duì)減少細(xì)胞凋亡起著決定性作用。結(jié)論 1、與正常肝臟組織相比miR-20b在人肝癌組織中高表達(dá),提示miR-20b的高表達(dá)與肝癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)具有密切相關(guān)。2、肝癌組織中miR-20b的表達(dá)水平與肝癌患者的臨床病理參數(shù)及總體生存期相關(guān),暗示miR-20b的表達(dá)量可以作為判斷肝癌患者預(yù)后的一個(gè)潛在的預(yù)測(cè)指標(biāo)。3. HIF-1α、VEGF為miR-20b直接靶基因,miR-20b對(duì)HIF-1α、VEGF3'-UTR有直接負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。4、正常環(huán)境中miR-20b高表達(dá)而調(diào)控HIF-1α、VEGF的表達(dá)；當(dāng)細(xì)胞處于低氧環(huán)境下由于HIF-1α、VEGF的高表達(dá)反過來調(diào)控miR-20b的表達(dá)。5、miR-20b和HIF-1α、VEGF在不同環(huán)境中相互調(diào)控影響細(xì)胞的增殖及細(xì)胞抗凋亡的能力。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

０ｂ在人肝癌組織中高表達(dá)逡逑Ｔ－ＰＣ民結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：與正常肝臟相比ｍｉＲ－２化在人肝癌組織中高意義。（Ｐ＜0．0ｌ）見圖１逡逑＊＊邋ｐ＝0．00逡逑２．０

miR-20b的表達(dá)與患者術(shù)后生存關(guān)系

圖５．在ＨｅｐＧ２細(xì)胞中的巧光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。將報(bào)告基因質(zhì)粒ＨＩＦ－ｌａ、逡逑ＶＥＧ巧＇－ＵＴＲｐＧＬ３ｃｍ和ｐＣＤＨ－ｍｉＲ２０ｂ質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染ＨｅｐＧ２細(xì)胞。結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)逡逑染ｍｉ民－２０ｂ的模擬物和野生型的ＨＩＦ－邋ｌｅｕ邋ＶＥＧＦ－３＇ＵＴＲ導(dǎo)致董光素酶活性的逡逑顯著降低，而共轉(zhuǎn)染用ｍｉＲ２０ｂ和突變體的ＨＩＦ－ｌｃｕ邋ＶＥＧＦ３Ｉ－ＵＴ民癸光素酶活逡逑性并沒有顯著改變。＊＊邋Ｐ邋＜０．０５與對(duì)照進(jìn)行比較。逡逑

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1 薛同敏;MiR-20b在肝癌中表達(dá)的意義及調(diào)控HIF-1α、VEGF對(duì)肝癌細(xì)胞（HepG2）增殖及凋亡的影響[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2810111