胃癌是全世界最主要的公共健康問題之一,每年的新發(fā)病例超過100萬。幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori,HP)慢性感染已被證實(shí)是胃癌最重要的危險(xiǎn)因素�；诟咄繙y序技術(shù)和生物信息學(xué)方法的人體微生物組研究使我們逐漸認(rèn)識到除HP外,人體胃中還存在由其它多種微生物構(gòu)成的微生態(tài)系統(tǒng),它們與胃部疾病,包括胃癌的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。其中已有不少研究發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)菌群失調(diào)與胃癌關(guān)系密切,且一些特定菌群具有成為診斷胃癌的生物學(xué)標(biāo)記物的潛力;也有一些研究發(fā)現(xiàn)口腔致病菌或共生菌在胃癌患者的胃內(nèi)富集,但直接分析胃癌患者口腔微生物特征的研究少之又少。同時(shí),這些關(guān)于微生物和胃癌關(guān)系的研究大都采用16S rRNA基因擴(kuò)增子測序的方法,該方法在物種鑒定上一般只能精確到屬的水平,且遺漏了微生物樣本中除16S rRNA基因外的其它大量微生物基因的信息,在微生物功能的注釋上也只能通過預(yù)測的方法。故本研究采用宏基因組學(xué)的方法分析胃癌(GC)患者和慢性淺表性胃炎(SG)患者胃內(nèi)和口腔微生物的特征,通過全基因組對比研究,探索人體口腔和胃內(nèi)菌群與胃癌的關(guān)系。本研究按照嚴(yán)格的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)成功招募了6名GC患者和5名SG患者,收集其胃沖洗液標(biāo)本和漱口液標(biāo)本進(jìn)行宏基因組建庫測序,并對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,得到高質(zhì)量、無宿主DNA污染的微生物DNA序列,再分別通過MetaPhlAn2和HUMAnN2對質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋和功能注釋,得到每個樣本的物種組成及其相對豐度和代謝通路組成及其相對豐度。然后分析樣本內(nèi)微生物的Alpha和Beta多樣性,采用LEfSe對兩組間微生物組成結(jié)構(gòu)和功能通路進(jìn)行對比研究,以探索特定菌群、微生物代謝功能與胃癌的關(guān)系,并尋找胃癌生物學(xué)標(biāo)志物。主要研究結(jié)果:1.通過宏基因組建庫測序及數(shù)據(jù)質(zhì)控,我們得到高質(zhì)量的微生物DNA序列。MetaPhlAn2物種注釋的結(jié)果中細(xì)菌DNA序列占比99.46±0.66%(mean±S.D.),其余為病毒序列,口腔樣本和胃樣本分別鑒定出204個和190個菌種;HUMAnN2功能注釋結(jié)果中細(xì)菌代謝通路占比超過99%,口腔樣本和胃樣本分別鑒定出301個和349個微生物代謝通路。2.兩組間微生物Alpha多樣性分析結(jié)果顯示:SG組胃內(nèi)菌群的豐富度(Observed species)顯著高于GC組,但兩組Shannon Index無顯著差異;SG組口腔菌群的豐富度和Shannon Index均高于GC組;提示SG組口腔和胃內(nèi)菌群的多樣性高于GC組。3.兩組間微生物Beta多樣性分析結(jié)果:基于Bray Curtis dissimilarity的PCoA分析顯示,兩組間胃內(nèi)菌群的相對豐度在整體上差異不顯著(PERMANOVA,R~2=0.164,P=0.067),但基于Jaccard Index的PCoA分析結(jié)果顯示其差異顯著(PERMANOVA,R~2=0.212,p=0.0037);以上兩種方法的計(jì)算結(jié)果均顯示,兩組間口腔菌群整體上差異顯著(Bray Curtis dissimilarity,R~2=0.221,P=0.002;Jaccard Index,R~2=0.232,P=0.017;PERMANOVA)。此結(jié)果說明兩組間的菌群結(jié)構(gòu)在整體上差異顯著。4.兩組間菌群差異分析及生物學(xué)標(biāo)志物篩選結(jié)果:使用LEfSe對兩組間胃內(nèi)菌群進(jìn)行比較分析顯示,共有44種細(xì)菌分類的相對豐度在GC組和SG兩組間存在顯著性差異,其中包括8個菌科,12個菌屬,18個菌種和6個菌株。我們根據(jù)菌種的平均相對豐度和流行度,首次發(fā)現(xiàn)了5個在GC組胃中顯著富集的優(yōu)勢物種,包括奈瑟氏菌屬、Alloprevotella、Aggregatibacter、Porphyromonas_endodontalis.t_GCF_000174815和Streptococcus_mitis_oralis_pneumoniae;首次發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢物種矢野口鞘氨醇菌在SG組中富集。用同樣的方法發(fā)現(xiàn)有13種細(xì)菌分類在GC組口腔樣本中富集,并從其中篩選出3個優(yōu)勢物種,包括Alloprevotella、Porphyromonas_endodontalis.t_GCF_000174815和奈瑟氏菌屬,此三種細(xì)菌同樣在GC組的胃樣本中富集,說明它們能在胃癌患者的上消化道大量增殖,具有成為胃癌標(biāo)志物的潛力。5.兩組間微生物代謝通路差異分析:PCoA分析發(fā)現(xiàn),兩組間口腔和胃內(nèi)微生物的代謝功能在整體上差異顯著。LEfSe分析顯示,兩組間共有34種胃內(nèi)菌群的代謝通路存在顯著性差異,而在口腔樣本中這種差異分布的代謝通路共有55種,這些差異代謝通路主要涉及糖類、氨基酸、脂質(zhì)、核苷酸的代謝。特別的,與細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)合成相關(guān)的代謝通路在GC組中富集,而與短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)生成相關(guān)的代謝通路在SG組中富集。綜上所述,我們首次通過宏基因組學(xué)的方法分析了GC患者的口腔和胃內(nèi)微生物的特征,并將其與SG患者比較,首次發(fā)現(xiàn)了一些與GC顯著相關(guān)的菌種和微生物代謝通路,從全基因組的角度擴(kuò)展了當(dāng)前對消化道微生物在胃癌中的作用的認(rèn)識,為尋找胃癌的預(yù)防、早期診斷和治療的靶點(diǎn)提供了新的視角和信息。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.2
【部分圖文】：

生物樣本中一共鑒定出 190 類菌種。如圖 3-1 所示，在門分類水平，G的胃菌群在相對豐度分布上無顯著性差異（Mann-Whitney U test, p>0.05群都集中在變形菌門（41.84% in GC and 62.13% in SG）、擬桿菌門（41d 24.54% in SG）、厚壁菌門(11.88% in GC and 9.18% in SG)和梭桿菌門(3d 2.01% in SG)；然而在綱分類水平，GC 組的β變形菌和γ變形菌的相對 SG 組，SG 組的α變形菌的相對豐度顯著高于 GC 組（Mann-Whitney5），此結(jié)果說明兩組間胃內(nèi)菌群的構(gòu)成在綱分類水平上有顯著差異。如圖門分類水平上，GC 組和 SG 組的口腔菌群集中在擬桿菌門（42.58±6.63%.24±5.8% in SG）、變形菌門（33.19±7.73% in GC and 20.35±4.82% in S(15.20±6.5% in GC and 23.26±2.53% in SG)、放線菌門(3.58±2.00% in4.17% in SG)、梭桿菌門(3.12±2.2% in GC and 3.36±1.75% in SG)，且 S門的相對豐度顯著高于 GC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Mann-Whitney087），說明兩組間口腔菌群在高分類水平上也存在顯著差異，且受試者的群的構(gòu)成顯然不同。

26圖 3-2 胃癌組（GC）與慢性淺表性胃炎組（SG）受試者口腔菌群的相對豐度在門分類水平的堆疊柱狀圖：GCm 和 SGm 分別表示兩組受試者組內(nèi)各細(xì)菌分類的均值。3.2.2 宏基因組多樣性分析結(jié)果3.2.2.1 胃菌群多樣性分析結(jié)果3.2.2.1.1 胃菌群 Alpha 多樣性分析結(jié)果我們使用 observed species 和 Shannon Index 來評估受試者胃內(nèi)菌群的 Alpha 多樣性。SG 組的 observed species 顯著高于 GC 組(Student's t-test, P=0.0118, 圖 3-3A)；而兩組間 Shannon Index 差異不顯著(Student's t-test, P=0.46, 圖 3-3B)。這說明 SG 組的胃菌群種類明顯多于 GC 組；但是當(dāng)同時(shí)把各菌種的相對豐度計(jì)算在內(nèi)時(shí)，兩組間微生物 Alpha 多樣性差異不顯著。

圖 3-3 兩組間胃內(nèi)菌群 Alpha 多樣性比較：A：兩組間 Observed species 比較結(jié)果，（Student'st-test, P=0.0118）；B：兩組間 Shannon Index 比較結(jié)果（Student's t-test, P=0.46）； GC,胃腺癌；SG，慢性淺表性胃炎。3.2.2.1.2 胃菌群 Beta 多樣性分析結(jié)果我們采用 PCoA 對兩組間 Bray Curtis dissimilarity 和 Jaccard Index 進(jìn)行分析，并使用 PERMANOVA 對分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。如圖 3-4A，最主要的兩個坐標(biāo)軸（PCoA1 和 PCoA2）能夠代表兩組間 Bray-Curtis dissimilarity 差異的 52.62%；如圖3-4B，最主要的兩個坐標(biāo)軸（PCoA1 和 PCoA2）能夠代表兩組間 Jaccard Index 差異的51.71%。兩組樣本在主坐標(biāo)軸上能很好的分開，表示兩組間胃內(nèi)菌群在整體上差異明顯。同時(shí) PERMANOVA 分析表明，兩組間在基于 Jaccard Index 的 PCoA 分析結(jié)果上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R2=0.212,p=0.0037）,而基于 Bray-Curtis dissimilarity 的 PCoA分析結(jié)果上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R2=0.164, P=0.067）。此結(jié)果說明當(dāng)只考慮物種存在與否時(shí)，兩組間菌群在整體上差異顯著；而當(dāng)納入菌群的相對豐度進(jìn)行評估時(shí)，兩組

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8 曹正W

本文編號：2807929