【摘要】：第一部分IFN-γ對肝癌細胞系表達galectin-9和EZH2的作用目的研究在IFN-γ刺激下肝癌細胞系中g(shù)alectin-9和EZH2表達情況方法使用重組人IFN-γ刺激Hep G2和Hep3B肝癌細胞系,模擬類似乙型病毒性肝炎相關肝癌中的高IFN-γ免疫微環(huán)境。在不同濃度IFN-γ刺激下和不同刺激時間下,使用免疫印跡法(western blot)和q PCR分別檢測Hep G2和Hep3B細胞中g(shù)alectin-9和EZH2蛋白和RNA水平的變化。在濃度梯度和時間梯度確定合適的IFN-γ濃度和刺激時間后,使用免疫熒光方法分別檢測Hep G2和Hep3B細胞中g(shù)alectin-9和EZH2的表達,直觀顯示galectin-9和EZH2在IFN-γ刺激下的變化趨勢。結(jié)果在IFN-γ刺激下,galectin-9的表達明顯上調(diào),且呈明顯的濃度依賴性和時間依賴性。同時,我們發(fā)現(xiàn)EZH2的表達跟galectin-9呈現(xiàn)相同的趨勢。結(jié)論IFN-γ刺激下,肝癌細胞系Hep G2和Hep3B中g(shù)alectin-9和EZH2表達增加。第二部分EZH2通過mi R-22調(diào)控galectin-9在肝癌細胞系中的表達目的研究EZH2通過何種方式調(diào)控galectin-9在肝癌細胞系中的表達方法首先,我們從三條EZH2特異性的小干擾RNA中篩選出兩條EZH2敲低效果最明顯的用于后續(xù)實驗。在肝癌細胞系Hep G2和Hep3B中分別轉(zhuǎn)染這兩條si RNA后,分別使用western blot和q PCR檢測galectin-9在蛋白和RNA水平的變化。然后,構(gòu)建EZH2的過表達質(zhì)粒載體p CMV-EZH2,將其轉(zhuǎn)染肝癌細胞系Hep G2和Hep3B,驗證過表達EZH2效果的同時,在蛋白和RNA水平檢測galectin-9的變化趨勢。最后,在使用IFN-γ刺激肝癌細胞系Hep G2和Hep3B的同時,轉(zhuǎn)染si EZH2,分別檢測EZH2敲低對IFN-γ誘導的galectin-9表達的影響。通過生物信息學方法預測可能在EZH2和galectin-9中起節(jié)點作用的mi RNA,構(gòu)建galectin-9 3’UTR區(qū)域的雙熒光素酶載體psi CHECK2-galectin-9,進一步驗證mi RNA對galectin-9的調(diào)控作用,并轉(zhuǎn)染相應的mi RNA的類似物及抑制劑后檢測galectin-9蛋白水平的改變。確定調(diào)控galectin-9的mi RNA后,我們進一步分別檢測了EZH2的過表達和敲低對該mi RNA表達的影響。從而證實EZH2通過該mi RNA間接調(diào)節(jié)galectin-9的表達。結(jié)果研究結(jié)果表明,使用si RNA敲低EZH2表達后,galectin-9表達在蛋白和RNA水平均明顯下調(diào)。而過表達EZH2后,galectin-9的表達則明顯上調(diào),而且敲低EZH2可部分阻斷IFN-γ誘導的galectin-9上調(diào)。生物信息學預測及后續(xù)驗證表明mi R-22通過轉(zhuǎn)錄后途徑調(diào)節(jié)肝癌細胞中g(shù)alectin-9的表達。而肝癌組織及細胞系中EZH2均與mi R-22表達呈負相關,過表達和敲低實驗證實EZH2通過mi R-22間接調(diào)控galectin-9的表達。結(jié)論EZH2通過mi R-22間接調(diào)控galectin-9在肝癌細胞中表達。第三部分EZH2通過MIR22HG啟動子區(qū)域組蛋白甲基化抑制mi R-22表達目的研究EZH2抑制mi R-22表達的分子機制方法mi R-22在肝癌細胞系中的表達與其母基因MIR22HG類似,有研究表明mi R-22由MIR22HG轉(zhuǎn)錄后剪切加工而成。我們通過UCSC檢索MIR22HG的啟動子區(qū)域,發(fā)現(xiàn)一個長達858 bp的甲基化島。針對這一區(qū)域我們設計了甲基化特異性引物,通過Hep G2和Hep3B細胞系甲基化特異性PCR(MSP)了解這一區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)。然后我們又在24對肝癌及癌旁組織中進行MSP檢測,進一步了解組織中這一區(qū)域的DAN甲基化狀態(tài)。然后,我們又對這一Cp G島進行了亞硫酸鹽測序PCR(BSP)檢測其甲基化狀態(tài)。為了進一步明確mi R-22啟動子區(qū)域的核心序列,我們將一系列mi R-22啟動子區(qū)的5’端截短序列克隆至p GL3Basic載體的多克隆位點,將其與p RL-TK共轉(zhuǎn)染肝癌細胞系后,雙熒光素酶報告基因分別檢測其熒光強度。確定啟動子區(qū)的核心序列后,我們針對這一區(qū)域設計了特異性的Ch IP引物,然后分別使用EZH2、H3K27me3、Ig G抗體在EZH2敲低、過表達的肝癌細胞系中,進行染色質(zhì)免疫共沉淀實驗檢測在這一核心區(qū)域相應蛋白的富集情況。為了進一步驗證Ch IP實驗的結(jié)果,我們檢索了ENCODE(Encyclopedia of DNA elements)在線數(shù)據(jù)庫,來研究這一區(qū)域相關蛋白的富集情況。結(jié)果我們在mi R-22轉(zhuǎn)錄起始位點附近發(fā)現(xiàn)了長約858bp的甲基化島,細胞和組織的甲基化特異性PCR結(jié)果均顯示mi R-22啟動子區(qū)域呈低DNA甲基化狀態(tài)。亞硫酸鹽測序PCR同樣證明這一區(qū)域呈低甲基化狀態(tài)。雙熒光素酶報告基因檢測啟動子區(qū)域5’端的截短載體活性發(fā)現(xiàn),mi R-22轉(zhuǎn)錄起始位點上游-337~-65區(qū)域為啟動子核心序列。在EZH2敲低、過表達、及對照細胞中分別進行染色質(zhì)免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)EZH2、H3K27me3在這一核心區(qū)域明顯富集,EZH2敲低可顯著降低其在這一區(qū)域的富集狀態(tài)。ENCODE數(shù)據(jù)庫中EZH2抗體在Hep G2細胞中的Ch IP-seq數(shù)據(jù)與我們的結(jié)果相似。結(jié)論EZH2通過mi R-22啟動子上游核心序列的組蛋白H3賴氨酸K27的三甲基化抑制mi R-22的轉(zhuǎn)錄,而非通過DNA的超甲基化。第四部分mi R-22和galectin-9對肝癌惡性生物學行為的影響目的在體內(nèi)和體外水平研究mi R-22和galectin-9對肝癌細胞系Hep G2惡性生物學行為的影響方法使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mi R-22前體及空白載體的Hep G2細胞系,篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)細胞株后,將其分別共轉(zhuǎn)染galectin-9過表達載體。Western blot檢測各穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中g(shù)alectin-9的表達水平。CCK-8細胞增殖實驗檢測各細胞系的增殖能力,流式細胞凋亡檢測分析凋亡細胞比例,并使用western blot檢測凋亡相關蛋白caspase-3、活化的caspase-3、BAX以及Bcl-2的表達。為了評估各細胞系的惡性行為,平板克隆形成實驗檢測其定植能力,并使用transwell遷移和侵襲實驗分別評估Hep G2細胞系的轉(zhuǎn)移和侵襲的能力。裸鼠皮下成瘤實驗評估各細胞系體外成瘤的能力,免疫組化分析各組瘤體中Ki-67及CD31表達情況。裸鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移模型來檢測各Hep G2細胞系遠處轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mi R-22前體的Hep G2細胞中g(shù)alectin-9表達下調(diào),CCK-8細胞增殖試驗提示mi R-22過表達能抑制腫瘤細胞增殖;流式細胞凋亡檢測記過顯示過表達mi R-22前體細胞中凋亡比例明顯增加;克隆形成實驗證明過表達mi R-22細胞克隆形成能力明顯下降;transwell轉(zhuǎn)移和侵襲實驗證明mi R-22的表達明顯抑制Hep G2細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。共轉(zhuǎn)染galectin-9后,有意思的是galectin-9和mi R-22一起協(xié)同抑制細胞增殖,促進凋亡,抑制克隆形成能力和轉(zhuǎn)移及侵襲能力。動物實驗中,成瘤實驗和腫瘤肺轉(zhuǎn)移實驗均證實mi R-22和galectin-9可協(xié)同抑制移植瘤的形成并抑制其轉(zhuǎn)移。結(jié)論mi R-22與galectin-9協(xié)同抑制肝癌細胞增殖,促進其凋亡,抑制其轉(zhuǎn)移和侵襲能力。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7
【圖文】：

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文間差異使用 Student t 檢驗進行分析。結(jié) 果1. IFN-γ 刺激對肝癌細胞系 galectin-9 表達的作用1.1. IFN-γ 濃度梯度對 galectin-9 表達影響分別使用 PBS 以及濃度為 0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml 的 IFN-γ 刺激人肝癌細胞系 HepG2 及 Hep3B。24 小時后檢測 galectin-9 在 RNA 和蛋白水平表達的改變，IRF1（胰島素反應因子 1）作為陽性對照。我們發(fā)現(xiàn)隨著 IFN-γ 濃度的增高，galectin-9 表達上調(diào)，呈明顯濃度依賴性（圖 1- 1）。

IRF1（胰島素反應因子 1）作為陽性對照。我們發(fā)現(xiàn)隨著 IFN-γ 濃度的增高，galectin-9 表達上調(diào)，呈明顯濃度依賴性（圖 1- 1）。.2. IFN-γ 刺激的時間對 galectin-9 表達的影響使用終濃度為 10ng/ml 的 IFN-γ 刺激肝癌細胞，在不同時間點檢測 galectin-9 及IRF1 的表達，發(fā)現(xiàn) galectin-9 表達上調(diào)呈時間依賴性（圖 1- 2）。圖 1- 1 IFN-γ 刺激下，肝癌細胞中 galectin-9 及 IRF1 表達上調(diào)，且呈濃度依賴性。

中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 在 IFN-γ 刺激下 EZH2 表達上調(diào)表明 IFN-γ 刺激能調(diào)節(jié)相關基因啟動子區(qū)域的組蛋白 H3 第化水平，改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象，從而調(diào)控基因的表達。EZH2 是的關鍵酶，因此我們研究在 IFN-γ 不同濃度及刺激時間作用。結(jié)果表明，EZH2 同樣呈現(xiàn)出濃度及時間依賴性（圖 1- 3

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 María L Bacigalupo;Malena Manzi;Gabriel A Rabinovich;María F Troncoso;;Hierarchical and selective roles of galectins in hepatocarcinogenesis, liver fibrosis and inflammation of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2013年47期

本文編號：2803437