【摘要】：目的:研究環(huán)狀RNA分子circSETD3在非小細胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥產(chǎn)生過程中的作用及其分子機制,為臨床非小細胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥的早期診斷與干預(yù)提供新的生物標志物和治療靶標。方法:選取吉非替尼敏感性非小細胞肺癌細胞株H292(簡稱為H292_S)和PC 9(簡稱為PC 9_S),采用逐步遞增法構(gòu)建吉非替尼獲得性耐藥細胞模型(分別命名為H292_R和PC 9_R);CCK-8和Western blotting法檢測耐藥前后細胞對吉非替尼的敏感性變化;RNA測序(RNA sequencing,RNA-seq)法篩選耐藥前后差異表達的circRNAs;Real-time PCR法驗證RNA測序的篩選結(jié)果;構(gòu)建circSETD3過表達和敲低的非小細胞肺癌細胞模型,通過CCK-8和流式細胞技術(shù)觀察其對細胞吉非替尼敏感性的影響;生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報告實驗篩選并驗證circSETD3與微小RNA(microRNA,miRNA)miR-520h的相互作用;生物信息學(xué)分析、Real-time PCR以及Western blotting法對circSETD3—miR-520h—ABCG2之間的三元關(guān)系進行分析鑒定。結(jié)果:1.耐藥前后差異表達的circRNAs的篩選及驗證:Real-time PCR方法驗證了6個共同上調(diào)的circRNAs在敏感株和耐藥株中的表達情況。結(jié)果表明:has_circ_0000567、has_circ_0000620、has_circ_0000655、has_circ_0006867這4個環(huán)狀RNA在2種耐藥株中均表達上調(diào)(P0.05);has_circ_0001147在2種耐藥株中均表達下調(diào)(P0.05)。其中has_circ_0000567(circSETD3)的差異變化最明顯。2.circSETD3功能研究:CCK-8結(jié)果表明,與陰性對照組相比,circSETD3過表達會提高細胞的生長增殖能力,而circSETD3敲低組細胞的增殖能力顯著降低。流式細胞儀檢測結(jié)果表明,與陰性對照組相比,circSETD3過表達組的細胞凋亡能力顯著下降,然而circSETD3敲低組的細胞凋亡能力明顯增強。3.circSETD3作用機制研究:首先,對circSETD3和miR-520h二元關(guān)系的驗證。熒光定量PCR結(jié)果表明,在H292_S和PC 9_S細胞中過表達circSETD3后,細胞中miR-520h的表達水平均降低;而在H292_R和PC 9_R細胞中敲低circSETD3后,細胞中miR-520h的表達水平均升高。其次,對mi R-520h和ABCG2二元關(guān)系的驗證。熒光定量PCR結(jié)果表明,在H292_S和PC 9_S細胞中轉(zhuǎn)染miR-520h mimics后,細胞中ABCG2的表達量均降低;而在H292_R和PC 9_R細胞中轉(zhuǎn)染miR-520h inhibitor后,細胞中ABCG2的表達量均升高。最后,對circSETD3—miR-520h—ABCG2三元關(guān)系的驗證。當(dāng)在H292_S和PC 9_S細胞中過表達circSETD3后,ABCG2的表達水平均升高,在此基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染miR-520h mimics后,ABCG2的表達水平均降低,其經(jīng)典底物Hoechst 33342的胞內(nèi)蓄積濃度隨之升高;當(dāng)在H292_R和PC 9_R細胞中干擾circSETD3后,ABCG2的表達水平均降低,在此基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染miR-520h inhibitor時,ABCG2的表達水平均升高。結(jié)論:環(huán)狀RNA分子circSETD3在非小細胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥的產(chǎn)生過程中出現(xiàn)表達上調(diào),降低了細胞對吉非替尼的藥物敏感性;circSETD3主要通過ceRNA機制發(fā)揮其生物學(xué)功能:circSETD3通過下調(diào)miR-520h的表達,解除miR-520h對外排性轉(zhuǎn)運蛋白ABCG2的降解作用,從而使ABCG2對細胞內(nèi)吉非替尼的外排功能增強,最終導(dǎo)致吉非替尼獲得性耐藥的產(chǎn)生。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
【圖文】：

3 結(jié)果3.1 吉非替尼獲得性耐藥非小細胞肺癌細胞株的驗證CCK-8 結(jié)果顯示，吉非替尼對 H292_S 和 H292_R 細胞生長增殖的半數(shù)抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為 108.63 nmol/L 和 982.37nmol/L，耐藥指數(shù)為 9.04；吉非替尼對 PC9_S 和 PC9_R 細胞生長增殖的 IC50值分別為 752.56 nmol/L 和 7875.62 nmol/L，耐藥指數(shù)為 10.5（圖 3.1.1）。Western blotting 結(jié)果表明，與吉非替尼敏感株 H292_S、PC9_S 細胞相比，耐藥株 H292_R、PC9_R 細胞用吉非替尼（1.5 μmol/L）處理后，p-EGFR、p-PI3K、p-AKT 表達下降的幅度顯著減少，而總的 EGFR、PI3K、AKT 表達量沒有明顯變化（圖 3.1.2）。由于 p-EGFR、p-PI3K、p-AKT 是 EGFR 通路的活化形式，因此該結(jié)果表明在耐藥細胞 H292_R、PC9_R 中，吉非替尼處理后對 EGFR 信號通路的抑制功能顯著下降，細胞對吉非替尼的敏感性顯著降低。

圖3.1.2吉非替尼對敏感細胞（H292_S和PC9_S）和耐藥細胞（H292_R和PC9_R）EGFR/PI3K/AKT信號通路的影響Fig 3.1.2 the effects of gefitinib on EGFR/PI3K/AKT signaling pathway in Parental Cells（H292_S and PC9_S）and resistant cells（H292_R and PC9_R）were detected by Westernblotting (*:P＜0.05, vs the control group, n=3)3.2 非小細胞肺癌細胞株吉非替尼獲得性耐藥前后差異表達 circRNAs的篩選提取吉非替尼敏感性與耐藥性非小細胞肺癌細胞株總 RNA，進行 RNA-seq 分析。采用 RPM （spliced reads per millon, RPM）法計算 circRNAs 的表達量，并利用生物信息學(xué)分析共同繪制差異表達 circRNAs 的火山圖（圖 3.2.1）。圖中灰色為沒有顯著性差異的 circRNA；紅色為顯著性上調(diào)的 circRNAs（P＜0.05 且 FC≥2）；綠色為顯著性下調(diào)的 circRNAs（P＜0.05 且 FC≥2）。RNA-seq 測序結(jié)果表明，

圖 3.2.1 敏感細胞和耐藥細胞中差異表達 circRNA 分布的火山散點圖。左：H292_S vs H292_R;右：PC9_S vs PC9_RFig3.2.1 The volcanic scatter plot of the differentially expressed circRNAs in cell lines. Left:H292_S vs H292_R; right: PC9_S vs PC9_R圖 3.2.2 H292_S vs H292_R 中，24 個 circRNA 顯著上調(diào)； PC 9_S vs PC 9_R 中，25 個 cirRNA顯著上調(diào)，其中有 6 個 cirRNA 共同上調(diào)（P＜0.05 且 FC≥2）

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本文編號：2800835