【摘要】：背景RNF139(Ring Finger Protein 139),是一個含有Ring-H2的多次跨膜蛋白。該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),擁有泛素連接酶的活性。最近一項非小細胞肺癌對白蛋白紫杉醇的耐藥組學研究中發(fā)現(xiàn)RNF139在白蛋白紫杉醇耐藥的腫瘤細胞系中的蛋白水平表達顯著升高。白蛋白紫杉醇作為目前胰腺癌客觀緩解率最高的化療藥物,其效果不好一直是困擾臨床的主要問題,因此我們設想RNF139在胰腺癌中是否會通過某些抗凋亡的相關分子機制導致腫瘤細胞對白蛋白紫杉醇產(chǎn)生敏感性,且目前在胰腺癌中尚未有關于RNF139的任何報道。通過預實驗結(jié)果以及在線數(shù)據(jù)庫分析,我們發(fā)現(xiàn)與胰腺組織相比,胰腺導管腺癌患者的手術標本中RNF139的mRNA水平以及蛋白水平表達量明顯升高;與正常胰腺導管細胞系相比,胰腺癌細胞系中的RNF139的表達也明顯上調(diào);RNF139與細胞凋亡相關基因呈明顯正相關。乏氧環(huán)境下,胰腺癌細胞系中RNF139的表達量明顯上調(diào)。從而,我們進一步設計實驗探索在胰腺癌中RNF139表達升高與患者的生存、預后以及各個臨床病理學參數(shù)的關系,以及RNF139在胰腺癌抗凋亡中的作用和調(diào)控機制,目的是從臨床水平、分子生物學水平、細胞水平及動物實驗水平等不同研究層次深入探索乏氧環(huán)境下胰腺導管腺癌中RNF139參與胰腺癌抗凋亡以及RNF139可能對乏氧的反饋調(diào)節(jié)的臨床意義與分子機制,為尋求新的胰腺癌治療靶點提供理論依據(jù)和應用基礎。方法1.進一步收集胰腺導管腺癌患者的組織石蠟標本擴大研究樣本量,進行連續(xù)切片,對HIF-1α及RNF139進行共定位免疫組化染色,之后從組織蛋白表達水平來統(tǒng)計兩者之間表達量的相關性,同時結(jié)合患者的臨床病理學參數(shù)綜合分析RNF139表達水平與各個臨床病理參數(shù)之間的關系。2.應用免疫印跡試驗(Western Blot,WB)、實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)等技術檢測胰腺癌細胞系以及正常胰腺導管細胞系中RNF139及HIF-1α的mRNA以及蛋白水平的表達量并分析其相關性;采用免疫熒光技術檢測RNF139在胰腺癌細胞中的細胞定位。3.應用分子克隆方法構建RNF139、HIF-1α過表達質(zhì)粒以及RNF139、HIF-1α的shRNA降表達質(zhì)粒,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系;用WB、RT-qPCR及檢測所構建穩(wěn)系RNF139及HIF-1α表達水平。4.應用TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)、流式細胞術等實驗方法檢測上述構建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的凋亡比例。應用瞬時轉(zhuǎn)染技術,在過表達HIF-1α的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系瞬時轉(zhuǎn)染RNF139的siRNA并檢測其凋亡比例的變化;在降表達HIF-1α的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中瞬時轉(zhuǎn)染過表達RNF139的質(zhì)粒,并比較其凋亡比例的變化。5.應用WB、RT-qPCR等檢測RNF139穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中VHL及HIF-1α的表達水平。在降表達RNF139的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中瞬時轉(zhuǎn)染VHL的過表達質(zhì)粒、在過表達RNF139的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中瞬時轉(zhuǎn)染降表達VHL的siRNA并比較其凋亡比例的變化。6.利用NOD-SCID小鼠構建胰腺癌皮下成瘤模型,記錄皮下腫瘤生長曲線。3周后取瘤體,體內(nèi)驗證RNF139對胰腺癌抗凋亡的影響。結(jié)果1.我們對搜集的115例手術標本進行了臨床相關性分析,并從其中隨機抽取8例成對標本進行RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn),與配對的胰腺正常組織相比RNF139在胰腺癌組織中呈高表達水平,且RNF139的高表達與胰腺癌患者的總生存預后呈負相關,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);分析TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)作為驗證隊列,結(jié)果一致。2.應用分子克隆技術,分別構建過表達RNF139穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系兩株(SW1990-pLV-RNF139、MIA PaCa2-pLV-RNF139)和降表達RNF139穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系兩株(SW1990-pLV-ShRNF139、MIA PaCa-2-pLV-ShRNF139),經(jīng)白蛋白紫杉醇處理后采用流式細胞術以及TUNEL檢測對照組以及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,發(fā)現(xiàn)過表達RNF139組凋亡比例顯著降低,降表達RNF139組凋亡比例顯著升高。WB檢測凋亡相關蛋白發(fā)現(xiàn),Caspase-12、Caspase-3等顯著改變。用各對照組及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系在裸鼠皮下構建皮下成瘤模型,發(fā)現(xiàn)與對照組相比降表達RNF139組腫瘤體積顯著減小;進一步研究證實,降表達RNF139組凋亡比例顯著升高。3.通過數(shù)據(jù)庫分析以及文獻提示,RNF139定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),該家族成員可影響細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。采用WB技術檢測瞬轉(zhuǎn)過表達及降表達RNF139胰腺癌細胞系發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關的蛋白eIF2α、CHOP等改變明顯,即RNF139可通過影響胰腺癌細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激來影響胰腺癌細胞的凋亡。4.胰腺癌細胞經(jīng)乏氧處理后,RNF139在mRNA水平及蛋白水平顯著上調(diào)。在組織水平、細胞水平,HIF-1α與RNF139的表達具有一致性。數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)RNF139的啟動子區(qū)有HIF-1α的特異性結(jié)合位點。染色質(zhì)免疫共沉淀實驗以及雙熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn),HIF-1α可與RNF139啟動子區(qū)的低氧反應元件結(jié)合并啟始其轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明,RNF139是HIF-1的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶點。5.WB檢測發(fā)現(xiàn),過表達RNF139的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中,HIF-1α顯著上調(diào),VHL表達顯著下調(diào);RNF139降表達細胞系中,HIF-1α顯著下調(diào),VHL表達顯著上調(diào)。在降表達RNF139的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中瞬時轉(zhuǎn)染VHL的siRNA,并用WB檢測發(fā)現(xiàn)RNF139沒有顯著改變,HIF-1α表達量顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明,RNF139可以通過VHL途徑影響HIF-1α的降解。6.RNF139是HIF-1在胰腺癌中發(fā)揮其抗凋亡作用的重要途徑之一。通過檢測過表達HIF-1α的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系及過表達HIF-1α后瞬時轉(zhuǎn)染降表達RNF139的細胞系的凋亡發(fā)現(xiàn),相較于前者,后者的凋亡比例明顯增加。結(jié)論1.RNF139在胰腺癌中表達升高,并且RNF139的高表達具有重要的臨床意義2.RNF139可通過影響胰腺癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激來參與胰腺癌細胞的抗凋亡3.HIF-1α可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控RNF139的表達從而影響胰腺癌的凋亡;HIF-1α的表達與白蛋白紫杉醇的治療效果相關4.RNF139可通過減少VHL的表達來上調(diào)HIF-1α的表達從而形成正反饋環(huán)路
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.9
【圖文】：

總生存的 Kaplan-Meier 曲線分析；用卡方檢驗分析 RNF139 蛋白表達水平與臨床病理參數(shù)之間的相關性；Cox 比例風險回歸模型用于多變量分析評估影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素。P值小于 0.05 時被認為是有統(tǒng)計學意義的。1.2 結(jié)果1.2.1 115 例胰腺腺癌患者基本信息在 123 例 PDAC 中，排除了 8 例非腫瘤致死病例，剩余病例 115 例。其中男性 65人、女性 50 人。年齡<65 歲 80人，年齡≥65 歲 35人。123例病例中，22 例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；外周血管侵犯 38 例；高分化 9 例，中分化 64 例，低分化34 例；I-II 期 82 例、III 期 23 例。43 例腫瘤的最大直徑≤2 cm。1.2.2RNF139 在胰腺癌組織標本中的表達RNF139 位于細胞漿里內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。分析組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RNF139 在胰腺導管腺癌中的表達水平較正常組織顯著升高（圖 1.1）。在新鮮的癌和癌旁配對組織的 mRNA 水平表達量也證實了 RNF139 在胰腺癌中的高表達（圖 1.2）

9 在胰腺癌及癌旁配對組織中 mRNA水平的表水平與臨床病理學參數(shù)之間的關系醫(yī)師的評分，我們將篩選出的 115例 PDAC低表達組。各病理學參數(shù)也分為兩組，再將 數(shù)進行統(tǒng)計分析，各臨床數(shù)據(jù)與 RNF139 的分析，可發(fā)現(xiàn)腫瘤大小、pT 分期以及一二站淋平相關，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）管腺癌中 RNF139 表達水平與臨床病理學參 例數(shù)RNF139 表達水平低 高 82 62 3023 10 13性結(jié)陽性）

學碩士學位論文 一、RNF139 在胰腺導管腺癌組織中高表達著縮短。我們使用同樣的方法在 TCGA數(shù)據(jù)庫中進行了驗即 RNF139 低表達組患者的生存期顯著優(yōu)于 RNF139 高表

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本文編號：2797406