【摘要】：目的:利用高通量第二代測(cè)序技術(shù)(nest generation sequencing,NGS)對(duì)中國地鼠口腔黏膜癌microRNA進(jìn)行測(cè)序,應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)方法分析,構(gòu)建miRNA差異表達(dá)譜,預(yù)測(cè)其靶基因,進(jìn)一步篩選出口腔黏膜癌分子標(biāo)志物,探討miRNA在口腔黏膜癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中的調(diào)控機(jī)制,從比較醫(yī)學(xué)的角度為口腔黏膜癌的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。方法:利用二甲基苯并蒽(9,10-Dimethy1-1,2-Benzanthracence,DMBA)涂抹法建立中國地鼠口腔黏膜癌模型;通過microRNA測(cè)序技術(shù)和生物信息分析構(gòu)建中國地鼠口腔黏膜癌組織和正常組織的差異表達(dá)的miRNA表達(dá)譜,預(yù)測(cè)靶基因后進(jìn)行GO富集分析和KEGG Pathway分析;用RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證部分顯著差異表達(dá)的miRNA;用免疫組化和RT-qPCR測(cè)定miR-21調(diào)控下PTEN/PI3K/AKT通路中PTEN、p-AKT及相關(guān)凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)水平。結(jié)果:在成功構(gòu)建中國地鼠口腔黏膜癌模型的基礎(chǔ)上,對(duì)口腔黏膜癌組織和正常組織進(jìn)行miRNA測(cè)序,共得到已知差異miRNA 268個(gè),其中137個(gè)表達(dá)上調(diào),131個(gè)表達(dá)下調(diào);進(jìn)一步分析獲得顯著差異的miRNA共有11個(gè),其中上調(diào)的miRNA有8個(gè)(miR-542-3p、miR-130b-3p、miR-142-5p、miR-34c-3p、miR-34c-5p、miR-34b-5p、miR-21-3p、miR-21-5p),下調(diào)的有3個(gè)(miR-504、miR-499-5p、miR-486-3p);對(duì)顯著差異表達(dá)的miRNA的靶基因預(yù)測(cè)并進(jìn)行GO和KEGG Pathway分析后,得到與OSCC相關(guān)的生物學(xué)過程的GO條目有340條、與細(xì)胞組分相關(guān)的GO條目有47條以及與分子功能相關(guān)的GO條目有46條和15條顯著富集通路,富集的GO條目主要在解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)、信號(hào)調(diào)控、細(xì)胞通訊調(diào)節(jié)、細(xì)胞突起、細(xì)胞骨架、神經(jīng)元部分、陰離子配位、轉(zhuǎn)移酶活性、ATP的結(jié)合等方面,極顯著的KEGG通路(q0.01)是Notch信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和慢性粒細(xì)胞白血病通路。預(yù)測(cè)得到208個(gè)新miRNA,其中有112個(gè)表達(dá)上調(diào),96個(gè)表達(dá)下調(diào);進(jìn)一步深度分析,得到顯著差異的miRNA共有3個(gè)(p0.05),其中上調(diào)的miRNA有1個(gè),下調(diào)的有2個(gè),同樣進(jìn)行生物信息學(xué)分析得到與細(xì)胞組分相關(guān)的1條GO條目。顯著差異表達(dá)的miRNA利用RT-qPCR得到驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果與miRNA-Seq結(jié)果高度一致。PTEN/PI3K/AKT通路中PTEN表達(dá)下調(diào)、p-AKT表達(dá)上調(diào);相關(guān)凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)下調(diào)、Bcl-2表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:本研究利用miRNA-Seq技術(shù)對(duì)中國地鼠口腔黏膜癌組織和正常組織的miRNA測(cè)序,發(fā)現(xiàn)11個(gè)miRNA有顯著差異,并預(yù)測(cè)出3個(gè)新的miRNA顯著差異表達(dá),從而導(dǎo)致Notch信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和慢性粒細(xì)胞白血病通路等15條與口腔黏膜癌相關(guān)的信號(hào)通路的活化;其中miR-21的兩個(gè)成熟變異體miR-21-3p和miR-21-5p的表達(dá)顯著增高,其直接靶基因PTEN下調(diào),影響PI3K/AKT通路的活化,進(jìn)而影響相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá),從而導(dǎo)致口腔黏膜癌的發(fā)生發(fā)展,miR-21可以作為分子標(biāo)志物指導(dǎo)OSCC臨床實(shí)踐。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.85
【圖文】：

NomalTR141563 2375 106.9 1.5 1.8 1.2 7.1 BTR141565 1115 50.2 2.1 1.8 1.5 6.7 BCancerTR140679 3500 157.5 1.9 1.6 1.2 8 ATR140681 3940 177.3 1.7 1.7 1.7 9.6 ATR147836 3200 144 2 1.9 1.4 7.8 B注：A. 樣品合格，符合建庫要求；B. 一些指標(biāo)切合測(cè)序要求，可試驗(yàn)建庫。2.3 測(cè)序原始數(shù)據(jù)及小 RNA 序列長度分布2.3.1 miRNA 測(cè)序原始數(shù)據(jù)原始數(shù)據(jù)以 FASTQ 格式呈現(xiàn)，示例如下（見圖 1-1）。其中，首行以@開始緊跟 Illumina 測(cè)序標(biāo)識(shí)別符和描述文字；第二行呈現(xiàn)堿基序列；第三行以“+”開始緊接 Illumina 測(cè)序標(biāo)識(shí)別符；第四行對(duì)應(yīng)堿基測(cè)序質(zhì)量。

.3.3 miRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)匯總將原始數(shù)據(jù)過濾之后統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表 1-3。從表中可以看出，Cancer 組測(cè)得始序列（Raw Reads）為 2.8~3.1×107，過濾后的干凈序列（Clean Reads）為 2.2~2.4×1占總序列的 77%~81%，其中約有98%的Clean Reads 的堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥20，94%~98≥30，將相同序列合并之后得到的序列種數(shù)（Unique Clean Reads）為 1.0~1.4×10omal 組測(cè)得的 Raw Reads 為 2.8~3.0×107，過濾后的 Clean Reads 為 2.1~2.3×107占總序列的 74%~78%，其中約有 98%的 Clean Reads 的堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥20，94%30，將相同序列合并之后得到的 Unique Clean Reads 為 1.2~1.7×106。綜上所述，究測(cè)序數(shù)據(jù)符合分析要求。圖 1-2 數(shù)據(jù)過濾結(jié)果圖注：橫坐標(biāo)表示樣本，縱坐標(biāo)表示百分比，不同顏色表示不同的過濾指標(biāo)。圖 1-3 百分比質(zhì)控圖注：橫坐標(biāo)表示樣本，縱坐標(biāo)表示百分比，不同顏色表示不同的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。

.3.3 miRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)匯總將原始數(shù)據(jù)過濾之后統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表 1-3。從表中可以看出，Cancer 組測(cè)得始序列（Raw Reads）為 2.8~3.1×107，過濾后的干凈序列（Clean Reads）為 2.2~2.4×1占總序列的 77%~81%，其中約有98%的Clean Reads 的堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥20，94%~98≥30，將相同序列合并之后得到的序列種數(shù)（Unique Clean Reads）為 1.0~1.4×10omal 組測(cè)得的 Raw Reads 為 2.8~3.0×107，過濾后的 Clean Reads 為 2.1~2.3×107占總序列的 74%~78%，其中約有 98%的 Clean Reads 的堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥20，94%30，將相同序列合并之后得到的 Unique Clean Reads 為 1.2~1.7×106。綜上所述，究測(cè)序數(shù)據(jù)符合分析要求。圖 1-2 數(shù)據(jù)過濾結(jié)果圖注：橫坐標(biāo)表示樣本，縱坐標(biāo)表示百分比，不同顏色表示不同的過濾指標(biāo)。圖 1-3 百分比質(zhì)控圖注：橫坐標(biāo)表示樣本，縱坐標(biāo)表示百分比，不同顏色表示不同的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李廣斌;王璐;田立志;徐萬海;;miRNA在腎癌中的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2017年21期

2 馮曉云;嚴(yán)玲玲;;miR-21、miR-155、miR-210的臨床表達(dá)意義及其與淋巴瘤病理特征的相關(guān)性分析[J];中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2017年23期

3 楊貞;郭新宇;李海霞;劉佳子;鄧偉民;;益氣血法對(duì)超排卵小鼠卵巢顆粒細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase3表達(dá)的影響[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2017年13期

4 梁峰;徐仁芳;;miRNA在腎癌中的研究進(jìn)展[J];系統(tǒng)醫(yī)學(xué);2017年09期

5 范鳴旭;趙艷濱;李博洋;王艷;;Notch基因通路與惡性腫瘤的進(jìn)展[J];實(shí)用腫瘤學(xué)雜志;2017年01期

6 Liangyu Ge;Siyu Liu;Long Xie;Lei Sang;Changyan Ma;Hongwei Li;;Differential mRNA expression profiling of oral squamous cell carcinoma by high-throughput RNA sequencing[J];The Journal of Biomedical Research;2015年05期

7 雷蕾;孫寧;杜巧榮;劉志芬;楊春霞;張克讓;;Notch信號(hào)通路在神經(jīng)精神領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2015年05期

8 Shao-Kai Zhang;Rongshou Zheng;Qiong Chen;Siwei Zhang;Xibin Sun;Wanqing Chen;;Oral cancer incidence and mortality in China, 2011[J];Chinese Journal of Cancer Research;2015年01期

9 馬玉英;付冬曉;馬微春;;PTEN和PDCD4在胃癌組織中表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系[J];寧夏醫(yī)學(xué)雜志;2015年01期

10 柏亞鐸;尹羿;汪琳;李勐偉;蒲靜;;高通量測(cè)序技術(shù)在動(dòng)物MicroRNA研究中的應(yīng)用[J];檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊;2014年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王裕;氟對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞的毒性作用及硒干預(yù)機(jī)制的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2796921