【摘要】：研究背景與目的肺癌約占全部惡性腫瘤死亡率的20%,是目前全球癌癥死亡的主要原因,其中超過80%的是非小細胞肺癌(NSCLC)。世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的資料顯示：肺癌無論是發(fā)病率(120萬/年)還是死亡率(110萬/年)均居全球癌癥首位,并且其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。根據(jù)我國腫瘤防治辦公室公布的資料：從上世紀70年代至今,我國肺癌死亡率上升了近5倍。大量的研究調(diào)查顯示：吸煙與肺癌的發(fā)病密切相關(guān),吸煙者比不吸煙者肺癌發(fā)生的幾率高近10倍。中國目前擁有著超過全球1/3的吸煙人群,由于肺癌發(fā)病率變化與吸煙率相比約滯后20-30年,在不久的將來,肺癌發(fā)病和死亡所占的比重在全球范圍內(nèi)將更加突出。由此可見,肺癌已成為威脅全球及我國居民生命和健康的重要疾病之一,是函待解決的重大公共衛(wèi)生問題。隨著肺癌分子生物學研究水平的不斷進步,關(guān)于非小細胞肺癌遺傳基因方向的研究也越來越多。肺癌作為一種多因素、多基因參與的復雜性狀疾病,其病因、發(fā)病機制及預后影響因素尚不完全清楚,臨床診斷及治療技術(shù)水平仍需不斷提高。例如,占所有肺癌80%以上的非小細胞肺癌(NSCLC)其5年生存率在美國為15%,在歐洲為10%,而在發(fā)展中國家僅為8.9%。盡管NSCLC預后判斷和劃分的主要依據(jù)仍然是臨床分期和病理組織學類型,然而,具有相同臨床特征的NSCLC患者,采用同樣的治療手段,其預后情況卻可能有很大的差異。以鉑類化療為例,鉑類藥物是非小細胞肺癌(NSCLC)化學治療的主要和首選藥物,然而以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案(如與紫杉醇等聯(lián)合)對晚期NSCLC的有效率僅約17-37%左右,中位生存期為6.7-11.3月,人們對患者個體間化療應(yīng)答差異產(chǎn)生的原因還不十分清楚,然而最新的研究提示我們遺傳因素可能在其中起到了關(guān)鍵作用。因此,通過生物標志物對NSCLC患者預后情況進行預測,并采取針對性的個體化治療(personalized therapy),將有助于改善生存質(zhì)量,延長患者的生存時間。研究表明,具有相同臨床特征及治療手段的患者,其生存時間的差異一方面與個體體質(zhì)有關(guān),另一方面也可能受到包括遺傳變異在內(nèi)的遺傳因素的影響,因此遺傳因素具有成為潛在新的預后預測標志物。人類基因組計劃(Human Genome Project, HGP)研究結(jié)果表明,不同個體的基因組99.9%是一樣的,在序列上僅存在極小(0.1%)的遺傳差異,主要是單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。SNP是指基因水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性,其在群體中的頻率不小于1%,包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化。由于在人類基因組中,三、四等位基因(allele)形式的SNP非常罕見,因此SNP也簡單指雙等位基因,其兩個不同等位基因的組合稱為基因型(genotype)。人類基因組中存在數(shù)量巨大的SNPs,其中一些可能影響相應(yīng)基因的表達、所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)或功能,進而影響個體催患疾病的可能性、對藥物的反應(yīng)性以及不同患病個體的預后。SNP在基因序列中的高密度、代表性、遺傳穩(wěn)定性,以及檢測的易實現(xiàn)等特點體現(xiàn)了新一代遺傳標記的優(yōu)越性,成為繼第一代限制性片段長度多態(tài)性標記和第二代微衛(wèi)星標記后的第三代基因遺傳標記,并被迅速接受從而成為遺傳研究領(lǐng)域中極為活躍的內(nèi)容。根據(jù)其在基因中的位置,SNP可分為基因編碼區(qū)SNP (Coding SNP, cSNP)和基因調(diào)控區(qū)SNP(Regulatory SNP, rSNP)。其中,cSNP根據(jù)是否改變編碼的氨基酸又可分為同義cSNP (Synonymous cSNP)和非同義cSNP (Non-synonymous cSNP)。同義cSNP指堿基序列的改變并不影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列,而非同義cSNP可改變編碼的氨基酸殘基的種類,從而使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。此外,出現(xiàn)在調(diào)控區(qū)的rSNP則可以通過影響與轉(zhuǎn)錄因子或miRNA的結(jié)合,引起基因表達水平的改變或mRNA的穩(wěn)定性及翻譯過程的變化,進而影響細胞正常功能。因此,這些潛在功能性SNPs通常被優(yōu)先選擇用于探討與疾病發(fā)生發(fā)展及預后的關(guān)系,從而為包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的防制及臨床治療決策提供科學依據(jù)。研究己發(fā)現(xiàn),細胞周期紊亂是腫瘤發(fā)生最主要的機制,細胞惡性化的核心事件是正常的細胞周期進程被破壞使腫瘤細胞順利進入細胞周期進程,相關(guān)調(diào)控蛋白和信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)生改變,失去分化能力,從而發(fā)生惡性增殖。除細胞周期調(diào)控因子外,趨化因子是另一類與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的家族。趨化因子是一類與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的家族。趨化因子是一類分子量8-12 kD、至少有2個保守半肌氨酸(Cys)組成的分泌型單鏈蛋白質(zhì),能夠激活和趨化白細胞,參與免疫調(diào)節(jié)和免疫病理反應(yīng)。根據(jù)其N端Cys順序,趨化因子可分為4類：CXC (α)、CC(β), C(γ)種和CX3C (δ)。趨化因子主要通過與其特定的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合,參與包括造血細胞的生成、白細胞的遷移與歸巢、胚胎的發(fā)育等許多正常生命活動,同時也參與包括炎性疾病、病毒感染、移植排斥、惡性腫瘤等眾多病理過程。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中,不同的趨化因子起著不同的作用：一部分趨化因子能促進腫瘤的增殖,促進血管形成,誘導腫瘤細胞移動和粘附內(nèi)皮細胞,加速腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移；一部分趨化因子能抑制腫瘤細胞生長和血管形成,激發(fā)機體特異性和非特異性免疫應(yīng)答,從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。研究表明,多數(shù)腫瘤可分泌多種異常高水平的趨化因子,其表達譜的差異可決定腫瘤浸潤白細胞的種類與浸潤程度,并且腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥細胞浸潤有著相似的形成過程,涉及到細胞滾動、黏附和跨內(nèi)皮遷移等。此外,己有多個報道發(fā)現(xiàn),CXC(a)和CC(p)等趨化因子的表達失調(diào)可影響包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、進展及預后。例如,肺癌細胞系中存在CXCL12的表達升高,且CXCL12的表觀沉默是NSCLC預后良好的獨立預測因子,CCL22的高表達與肺癌的進展及復發(fā)風險顯著相關(guān),高CXCR4/CXCL12表達水平與肺癌疾病進展相關(guān)聯(lián),并提示較差的預后(12,25,42-44)。體外和體內(nèi)的實驗表明,在腫瘤微環(huán)境中,CXCR4/CXCL12相互作用可能促進局部腫瘤的生長,而CXCR4高表達的腫瘤細胞具有更大的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛力。趨化因子CXCL12即基質(zhì)衍生因子(stromal cell-derived factor, SDF-1),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、淋巴細胞的發(fā)育成熟及歸巢、調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)、促進血管生成等方面發(fā)揮著重要的作用。目前已知CXCL12在多種惡性腫瘤患者體內(nèi)高表達,如乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、結(jié)腸癌及肺癌等。但在NSCLC患者中表達情況目前研究相對較少。2010年Imai等報道,CXCL12在肺癌細胞系中表達明顯高于正常支氣管上皮細胞；小細胞肺癌細胞株與NSCLC細胞相比其表達無明顯差異；在NSCLC腫瘤組織中CXCL12表達明顯高于支氣管上皮正常組織,研究還發(fā)現(xiàn)NSCLC患者體內(nèi)CXCL12表達與CXCR4和CXCR7表達相關(guān)性較低。另外有研究發(fā)現(xiàn)在女性、不吸煙、腺癌患者中CXCL12表達明顯升高,結(jié)合EGFR與CXCL12的關(guān)系分析,發(fā)現(xiàn)伴有EGFR突變的肺腺癌患者中CXCL12表達明顯較野生型患者高,但差異無統(tǒng)計學意義,由于試驗中EGFR檢測患者例數(shù)較少,CXCL12與EGFR具體表達相關(guān)性有待于進一步研究。針對NSCLC Ⅰ,Ⅱ期患者CXCL12表達情況與預后分析研究發(fā)現(xiàn),CXCL12高表達組與低表達組患者預后總生存期無明顯差異,而對于晚期NSCLC患者,CXCL12表達與患者預后總生存期關(guān)系的研究報道較少。有研究指出CXCL12表達高的肺腺癌患者預后較差,具體原因及機制目前未見明確報道,可能與CXCL12異常甲基化及其受體異常表達有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),CXCL12在不同性別間作用不同,可能與男性患者中CXCL12異常甲基化表達缺失明顯高于女性有關(guān),具體機制也有待于研究證實。在NSCLC的CXCL12高表達患者中,假設(shè)如果阻止CXCL12與其受體結(jié)合從而阻斷其信號傳導通路,是否可以抑制腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移呢?Phillips等通過對嚴重免疫缺陷小鼠使用CXCL12抗體來中和小鼠體內(nèi)CXCL12水平,從而抑制了腫瘤轉(zhuǎn)移,這一實驗證明了這一想法的可行性。體外實驗進一步證實可以使用siRNA或抗CXCL12抗體來抑制肺癌細胞增殖。目前為止,對于NSCLC特別是CXCL12高表達患者,通過抑制CXCL12而阻斷其信號轉(zhuǎn)導通路是否可以治療肺癌,該通路阻斷后對人體正常生理機能有無影響未發(fā)現(xiàn)有明確報道,有待于深入研究。在編碼CXCL12的基因3’轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)存在第801位的鳥嘌呤(G)向腺嘌呤(A)突變的多態(tài)性(記為CXCL12-3'G801A, rs1801157),該基因位點的多態(tài)性與哮喘、HIV感染和移植排斥反應(yīng)等的相關(guān)性已有報道。近年來,多項研究表明CXCL12-3'G801A基因多態(tài)性參與腫瘤形成、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移的多個過程。而侵襲和轉(zhuǎn)移又是導致惡性腫瘤治療失敗的主要原因。前期研究表明前列腺癌患者中趨化因子CXCL12801核苷酸GA+AA基因型明顯高于正常健康人群,而且CXCL12 G801A基因型患者有更多的淋巴轉(zhuǎn)移。但是在對于CXCL12-G801A基因多態(tài)性在非小細胞肺癌的影響方面的研究極少,目前全球范圍內(nèi)僅見2篇相關(guān)報道。綜上所述,一系列證據(jù)表明,趨化因子家族中相關(guān)基因表達或功能的改變在包括NSCLC在內(nèi)的腫瘤發(fā)生發(fā)展及預后中發(fā)揮重要作用。然而,迄今為止,有關(guān)上述基因的多態(tài)性與NSCLC的預后分析還較少,己發(fā)表的2篇文獻也僅是關(guān)注少數(shù)基因少數(shù)位點并僅針對中亞及臺灣人群的研究。上述研究對于腺癌EGFR突變與CXCL12-G801A的關(guān)系也未做研究,同時對于中國內(nèi)陸地區(qū),CXCL12-G801A基因多態(tài)性對于中國漢族人群非小細胞肺癌的影響未見報道,本研究的目的就是通過聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測非小細胞肺癌CXCL12-G801A基因型分布,并進一步探討CXCL12-G801A基因多態(tài)性對我國漢族人群非小細胞肺癌易感性和疾病進展、預后的影響。研究方法：1.從我院2012年1月到2014年1月入院治療的患者中選取408例病理確診為非小細胞肺癌的患者,另外招募303個健康個體一起進行該項研究(表1)。非小細胞肺癌患者沒有接受術(shù)前放療或化療。招募的303名健康志愿者均來自周邊省、市的漢族居民,并且與入組非小細胞肺癌患者之間沒有任何血緣關(guān)系。收集非小細胞肺癌組與健康組患者年齡、性別及吸煙史。研究計劃獲上述參與單位倫理委員會批準,所以受試者均知情并同意參與。2.分別抽取空腹外周血5ml,采用蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析法提取兩組研究對象的基因組DNA,采用PCR-RFLP分析方法和PIRA-PCR方法檢測CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G,A/A和A/G)頻率分布。3.采用SPSS1 8.0統(tǒng)計軟件分析,所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD,x±S)表示。兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗；組間等位基因型或等位基因的比較采用χ2檢驗。P0.05為統(tǒng)計學上有顯著性差異。結(jié)果：1.CXCL12-G801A基因型判斷突變的等位基因A經(jīng)MspI酶切反應(yīng)后,G/G純合子被切為202及100 bp兩條帶,而A/A純合子仍為302 bp,A/G雜合子則顯示為302,202及100 bp 3條帶(圖1)2.病例組和健康對照組的一般資料非小細胞肺癌患者組與健康對照組間的性別構(gòu)成無顯著性差異(χ23.384,P=0.066)。3.兩組患者的年齡情況病例組和對照組平均年齡分別是61.31±10.02歲和62.50±9.86歲。兩組相比無統(tǒng)計學意義(P=0.115)。非小細胞肺癌患者組與健康對照組間的年齡構(gòu)成無顯著性差異。4. CXCL12-G801A SNPs與非小細胞肺癌發(fā)病風險的分析病例組和對照組CXCL12-G801A G/G基因型的頻率分別是59.56%和66.37%。病例組和對照組CXCL12-G801A A/A基因型的頻率分別為10.29%和7.92%。病例組和對照組CXCL12-G801A A/G雜合的頻率分別為30.15%和25.74%。病例組和對照組CXCL12-G801A三種基因型比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.527,P=0.171)。5. CXCL12-G801A等位基因分布與非小細胞肺癌易感性的關(guān)系CXCL12-G801A基因型及等位基因在健康對照組(χ2=0.880,P=0.644)及NSCLC組(χ2=0.835,P=0.659)的分布均處于Hardy-Weinberg平衡,NSCLC組CXCL12-G801A多態(tài)性等位基因G及A頻率分別是74.63%、79.21和25.37%、20.79%, CXCL12-G801A多態(tài)性等位基因G及A頻率與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.495,P=0.114)。6.通過病例組和對照組的研究,我們也沒有觀察到與CXCL12-G801A多態(tài)性顯著關(guān)聯(lián)的臨床參數(shù)和流行的基因型。7.根據(jù)病理分型和肺癌分期分析CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G, A/A,A/G)分布無統(tǒng)計學意義(x2= 1.349, P=0.509; x2= 12.141, P=0.059)。 CXCL12-G801A基因多態(tài)性與非小細胞肺癌的病理分型和肺癌分期無相關(guān)性。8、CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G, A/A, A/G)與肺腺癌的EGFR突變無相關(guān)性(χ2=1.196,P=0.550)。9、非小細胞肺癌中,CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G, A/A,A/G)1年生存率分別為G/G組33.75%、G/A組32.52%,A/A組33.33%,三種基因型1年生存率比較無統(tǒng)計學意義(χ2=3.096,P=0.213)。結(jié)論：1. CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G, A/A, A/G)分布與中國漢族人群非小細胞肺癌的發(fā)病率無相關(guān)性。CXCL12-G801A基因多態(tài)性和中國漢族人群非小細胞肺癌發(fā)病風險無關(guān)。CXCL12-G801A基因多態(tài)性不是中國漢族人群非小細胞肺癌的危險因素。2. CXCL12-G801A多態(tài)性等位基因A和G的分布與中國漢族人群非小細胞肺癌的發(fā)病率無相關(guān)性。CXCL12-G801A多態(tài)性等位基因A和G的分布不是中國漢族人群非小細胞肺癌的危險因素。3. CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G,A/A,A/G)與中國漢族人群非小細胞肺癌的病理分型和肺癌分期無相關(guān)性。4. CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G,A/A,A/G)與中國漢族人群肺腺癌的EGFR突變無相關(guān)性。5. CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G, A/A, A/G)與非小細胞肺癌1年生存率無相關(guān)性。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【圖文】：

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本文編號：2794571