【摘要】：目的:癌癥惡病質是由多種因素相互作用所導致的一種重要的疾病綜合征,主要表現(xiàn)為進行性的骨骼肌萎縮,嚴重影響惡性腫瘤患者的生活質量及預后。癌癥惡病質的骨骼肌萎縮是多種機制共同作用造成的結果,這些機制包括骨骼肌細胞蛋白代謝失衡、骨骼肌細胞損傷以及骨骼肌再生障礙等。目前尚無有效的臨床治療方法用于緩解癌癥惡病質的肌肉萎縮。Ghrelin為具有多種生物學活性的小分子多肽,辛酰化ghrelin(AG)和非辛�；痝hrelin(UnAG)均可以緩解多種疾病導致的骨骼肌萎縮,但其能否治療癌癥惡病質的骨骼肌萎縮卻鮮有報道,具體作用機制也尚不明確,值得進一步研究。本研究通過體外細胞共培養(yǎng)模型和癌癥惡病質小鼠模型探討:(1)Ghrelin對共培養(yǎng)環(huán)境下肌管細胞萎縮的影響及其機制;(2)Ghrelin對共培養(yǎng)環(huán)境下成肌細胞凋亡的影響及其機制;(3)Ghrelin對癌癥惡病質小鼠骨骼肌消耗的治療作用及其機制。本研究為進一步明確ghrelin對癌癥惡病質骨骼肌萎縮的治療機制及其臨床應用提供更多理論依據(jù)。方法:第一部分:小鼠C2C12成肌細胞誘導分化為肌管細胞并鑒定;肌管細胞與CT26細胞共培養(yǎng),觀察不同共培養(yǎng)時間對肌管細胞肌蛋白代謝的影響;將不同濃度的AG或UnAG分別作用于肌管細胞和CT26細胞,觀察其對細胞活性和增殖的影響;將不同濃度的AG或UnAG作用于共培養(yǎng)的肌管細胞24小時,觀察其對肌管細胞肌蛋白代謝的影響;將AG或UnAG作用于正�；蚬才囵B(yǎng)的肌管細胞,檢測其對肌蛋白代謝調(diào)節(jié)因子的表達和活性以及培養(yǎng)基中促炎因子和myostatin含量的影響。第二部分:C2C12成肌細胞與CT26細胞共培養(yǎng),觀察不同共培養(yǎng)時間對成肌細胞凋亡的影響;將不同濃度的AG或UnAG作用于共培養(yǎng)的成肌細胞24小時,觀察其對成肌細胞凋亡的影響;將AG或UnAG作用于正�；蚬才囵B(yǎng)的成肌細胞,檢測細胞內(nèi)線粒體功能以及凋亡途徑相關蛋白和凋亡調(diào)控相關蛋白的表達和活性,并且通過使用SP600125和LY294002這兩個信號通路抑制劑,進一步明確這些調(diào)控機制的參與。第三部分:將CT26細胞接種于雄性BALB/c小鼠背部皮下成瘤,構建癌癥惡病質小鼠模型,觀察AG或UnAG的干預對癌癥惡病質小鼠骨骼肌萎縮、血清生化指標和促炎因子含量的影響,并檢測其對骨骼肌內(nèi)肌蛋白代謝調(diào)節(jié)因子的表達和活性的影響。結果:第一部分:(1)共培養(yǎng)可以引起明顯的肌管細胞萎縮和MHC含量減少,AG及UnAG的干預可以緩解這些變化。(2)AG及UnAG作用于共培養(yǎng)的肌管細胞后可以抑制細胞內(nèi)鈣蛋白酶、NF-κB及FoxO3a的過度激活,上調(diào)細胞內(nèi)Akt活性,減少atrogin-1和MuRF1的表達,并降低細胞內(nèi)的自噬水平。(3)AG及UnAG可以減少共培養(yǎng)的肌管細胞內(nèi)TNF-α和myostatin的表達和分泌,從而減少培養(yǎng)基內(nèi)TNF-α和myostatin的含量。第二部分:(1)共培養(yǎng)可以引起成肌細胞線粒體膜電位喪失和線粒體蛋白釋放,引起成肌細胞內(nèi)caspase-3片段、PARP片段以及核小體碎片的增加,并且增加成肌細胞凋亡率,AG及UnAG的干預可以緩解這些變化。(2)共培養(yǎng)可以引起成肌細胞內(nèi)JNK的激活并且抑制Akt的活性,從而增加胞質內(nèi)tBid含量和線粒體上Bax的含量,并且減少線粒體上Bcl-2含量,AG及UnAG可以在一定程度上抑制這些變化。第三部分:(1)AG及UnAG增加荷瘤小鼠肌組織和脂肪組織的重量以及肌纖維的橫截面積,抑制荷瘤小鼠腓腸肌內(nèi)鈣蛋白酶系統(tǒng)的異常激活、游離肌絲的產(chǎn)生以及atrogin-1的表達。(2)AG及UnAG增加荷瘤小鼠腓腸肌內(nèi)Akt活性,并且減少FoxO3a的表達和活性。(3)與正常組相比,惡病質小鼠血清總蛋白和白蛋白含量下降,血糖降低,血清甘油三酯含量升高,AG及UnAG的干預可以緩解這些改變。(4)惡病質小鼠血清TNF-α和IL-1β含量明顯高于正常組,AG及UnAG能不同程度地逆轉這些改變。結論:(1)本研究第一部分采用的共培養(yǎng)模型可以誘導肌管細胞萎縮和肌蛋白代謝異常,可以在一定程度上模擬癌癥惡病質下肌纖維的體內(nèi)環(huán)境。(2)共培養(yǎng)體系內(nèi)的CT26細胞和肌管細胞可以通過各自分泌的細胞因子相互作用,這些因子通過影響多個調(diào)控肌蛋白代謝的通路而引起肌管細胞萎縮。AG及UnAG通過抑制鈣蛋白酶活性而影響這些肌蛋白代謝調(diào)節(jié)通路,從而在促進肌蛋白合成的同時也抑制肌蛋白分解,緩解共培養(yǎng)引起的肌管細胞萎縮,表明AG及UnAG具有治療癌癥惡病質骨骼肌肌蛋白代謝失衡的潛能。(3)本研究第二部分采用的共培養(yǎng)模型可以誘導成肌細胞凋亡,可以在一定程度上模擬癌癥惡病質下成肌細胞的體內(nèi)環(huán)境。(4)共培養(yǎng)可以引起成肌細胞內(nèi)JNK的激活并且抑制Akt的活性,從而影響B(tài)cl-2蛋白家族并激活線粒體凋亡途徑,引起細胞凋亡。AG及UnAG可以抑制JNK的活性和再激活Akt,從而抑制線粒體凋亡途徑的激活,減少共培養(yǎng)的成肌細胞的凋亡,表明AG及UnAG具有治療癌癥惡病質骨骼肌再生障礙的潛能。(5)AG及UnAG可以抑制荷瘤小鼠骨骼肌內(nèi)鈣蛋白酶系統(tǒng)的激活,從而減少肌原纖維分解。通過抑制鈣蛋白酶系統(tǒng)的激活,AG及UnAG可以增加荷瘤小鼠骨骼肌內(nèi)Akt的活性,從而抑制FoxO3a的活性,下調(diào)atrogin-1的表達,減少肌蛋白降解,抑制骨骼肌萎縮。AG及UnAG還可以改善癌癥惡病質小鼠的營養(yǎng)物質代謝,并且減少血清促炎因子含量,從多個方面對癌癥惡病質起到治療作用。我們的研究表明AG及UnAG有望成為治療癌癥惡病質的新方法。
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730
【圖文】：

實驗結果1.成肌細胞向肌管細胞的誘導分化及鑒定C2C12 為 Yaffe[15]等人于 1977 年首先建立的小鼠成肌細胞株，其在完全培養(yǎng)基中可以不斷進行分裂增殖，而在分化培養(yǎng)基中單核的星形成肌細胞可以分化并相互融合成為多核的長條形肌管細胞。分化過程中，細胞持續(xù)表達生肌分化因子 D（MyoD）和肌細胞生成素（myogenin）等促肌合成因子并且合成肌球蛋白（myosin）等肌蛋白[16, 17]。實驗中通過對細胞內(nèi)肌球蛋白重鏈（MHC）進行細胞免疫熒光檢測，我們觀察到，成肌細胞經(jīng)誘導分化后，細胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)多核長條形細胞，且該細胞 MHC 檢測陽性（如圖 1A 所示）。同時，WB結果表明，誘導分化后的細胞高表達 MyoD、myogenin 及 MHC（如圖 1B 所示）。以上實驗結果表明，經(jīng)誘導分化后，成肌細胞已成功分化成為肌管細胞。

圖 2. 不同共培養(yǎng)時間對肌管細胞直徑和肌蛋白代謝的影響。（A）肌管細胞免疫熒光染色結果。放大倍率為 100 倍，標尺為 100μm。（B）肌管細胞直徑分析。各組肌管細胞的直徑都標準化至 NC 組的均值。（C）肌管細胞內(nèi) MHC 的蛋白含量。（D）MHC 蛋白含量的灰度分析。各組 MHC 蛋白的灰度值均標準化至相應的 NC 組的均值。（*P < 0.05, **P <0.01, ***P < 0.001）3. 不同濃度的 AG 或 UnAG 對共培養(yǎng)環(huán)境下肌管細胞直徑和肌蛋白代謝的影響在選擇作用于細胞的 AG 或 UnAG 濃度時，我們主要參考既往文獻報道的10nM 和 100nM[18-21]，同時我們也檢測更低（1nM）和更高（1uM）的藥物濃度。在細胞毒性實驗中，這 4 種濃度的 AG 或 UnAG 均未表現(xiàn)出對肌管細胞的細胞毒性（如圖 3 所示）。將不同濃度的 AG 或 UnAG 作用于共培養(yǎng)的肌管細胞 24h 后，我們發(fā)現(xiàn)，10nM、100nM 和 1uM 的 AG 或 UnAG 可緩解共培養(yǎng)導致的肌管細胞萎縮，且 100nM 藥物濃度的效果強于 10nM，但 1uM 和 100nM 的作用效果無明顯差異，而 1nM 的藥物濃度未表現(xiàn)出緩解效果（如圖 4A、4B 所示）。這一結果

圖 3. 不同濃度的 AG 及 UnAG 對正常肌管細胞活性的影響。CCK8 法測定藥物濃度梯度增加的 AG 或 UnAG 干預后肌管細胞的活性，各組之間無顯著差異（P > 0.05）。

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 徐力;鹿競文;;癌癥惡病質中醫(yī)診治體會[J];中醫(yī)臨床研究;2012年23期

2 趙艷鳳;姜達;;癌性惡病質發(fā)生的分子機制及其逆轉[J];實用腫瘤學雜志;2007年02期

本文編號：2793400