【摘要】：目的建立對吉西他濱耐藥(gemcitabine-resistant,GR)的人胰腺癌細胞株作為研究對象,觀察耐藥細胞株與親本細胞株之間形態(tài)和惡性生物學行為的差異,探討miR-223調控胰腺癌耐藥的可能分子機制,以及miR-223抑制劑聯合大豆異黃酮協同改善胰腺癌對化療藥物吉西他濱的耐藥作用。方法1.長期持續(xù)吉西他濱誘導的方法建立胰腺癌耐藥細胞株,包括AsPC-1 GR、PANC-1 GR和BxPC-3 GR細胞;利用MTT檢測細胞活力的方法驗證耐藥細胞株的建立;顯微鏡下觀察耐藥細胞與親本胰腺癌細胞之間形態(tài)的差異;細胞劃痕實驗、transwell遷移和侵襲實驗檢測耐藥細胞與親本細胞之間細胞遷移和侵襲能力的差異;細胞粘附和脫落實驗驗證耐藥細胞與親本細胞之間細胞粘附和脫落的改變;qRT-PCR和蛋白印跡技術檢測EMT特異性標志物的改變,包括E-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、ZEB1和ZEB2。2.qRT-PCR檢測miR-223在人胰腺癌細胞和其耐藥細胞之間表達的差異;向胰腺癌AsPC-1 GR和PANC-1 GR細胞轉染miR-223抑制劑后觀察細胞形態(tài)的改變,qRT-PCR和蛋白印跡技術檢測EMT標志物mRNA和蛋白水平改變;此外劃痕實驗、transwell實驗及細胞脫落和粘附實驗檢測轉染miR-223抑制劑后,AsPC-1 GR和PANC-1 GR細胞遷移和侵襲能力的差異、細胞脫落和粘附的改變;qRT-PCR和蛋白印跡方法檢測轉染mi R-223抑制劑后,AsPC-1 GR和PANC-1 GR細胞內FBW7和Notch1的改變;下調miR-223后,利用MTT的方法檢測AsPC-1GR和PANC-1 GR細胞對化療藥物吉西他濱敏感性的影響。3.MTT檢測大豆異黃酮對人胰腺癌AsPC-1 GR和BxPC-3 GR細胞生長的抑制作用;qRT-PCR檢測大豆異黃酮對AsPC-1 GR和BxPC-3 GR細胞miR-223表達的影響;miR-223抑制劑與大豆異黃酮聯合應用,實驗分組如下:對照組、miR-223抑制劑組、大豆異黃酮組、miR-223抑制劑與大豆異黃酮聯合應用組,觀察這4組對AsPC-1 GR和Bx PC-3 GR細胞形態(tài)改變、EMT標志物mRNA和蛋白表達水平的影響;按照上述分組檢測AsPC-1 GR和BxPC-3 GR細胞中FBW7和Notch1的影響;按照上述分組檢測AsPC-1 GR和BxPC-3 GR細胞惡性生物學行為的改變,包括細胞劃痕實驗、transwell遷移和侵襲實驗檢測各組細胞遷移和侵襲能力的差異,以及細胞粘附和脫落實驗驗證各組細胞脫落和粘附的差異;MTT檢測miR-223抑制劑和大豆異黃酮聯合應用后,AsPC-1 GR和BxPC-3 GR細胞對化療藥物吉西他濱的敏感性改變的影響。結果:1.耐藥細胞株的建立:逐漸增加吉西他濱的濃度持續(xù)誘導細胞超過六個月,最終細胞能夠達到穩(wěn)定生長,其中AsPC-1細胞株最終誘導濃度為100μM,PANC-1的最終誘導濃度達到5μM,而BxPC-3細胞的最終誘導濃度為6μM;MTT結果顯示,最終誘導濃度的吉西他濱對親本細胞的生長出現明顯抑制,而對耐藥細胞株沒有明顯的抑制作用;顯微鏡下觀察3株人胰腺癌細胞形態(tài)的改變,發(fā)現原始的親本細胞形態(tài)短、圓,耐藥株細胞的形態(tài)變細長,呈梭形,細胞由上皮形態(tài)特征向間質細胞形態(tài)轉化(EMT);細胞劃痕和transwell遷移實驗結果顯示,耐藥株比親本細胞具有更明顯的遷移能力;Transwell侵襲實驗顯示,耐藥細胞的侵襲能力明顯高于親本細胞;細胞粘附和脫落實驗結果顯示,耐藥細胞株比親本細胞顯示出更明顯的粘附和脫落能力;此外,EMT標志物檢測結果顯示體現上皮細胞特征的標志物E-caderin的mRNA和蛋白水平在耐藥細胞株中是顯著下調的,而反映間質細胞特征的標志物Vimentin和EMT-TFs如Slug、Snail、ZEB1和ZEB2的mRNA和蛋白水平顯著升高。2.與其親本細胞相比,我們所誘導的3株胰腺癌耐藥細胞株均高表達miR-223,提示miR-223可能與耐藥的發(fā)生有關;使用miR-223抑制劑下調AsPC-1GR和PANC-1 GR細胞內miR-223表達后,顯微鏡下觀察發(fā)現細胞形態(tài)發(fā)生逆轉,從細長的梭形向短、圓形轉變,即由間質細胞形態(tài)向上皮細胞形態(tài)轉化(MET);miR-223抑制劑作用后,AsPC-1 GR和PANC-1 GR細胞上皮細胞標志物分子E-cadherin的轉錄水平明顯升高,而間質細胞標志物的轉錄水平顯著下調,同樣,E-cadherin的蛋白水平明顯上升,而間質細胞標志物Vimentin和EMT-TFs如snail、slug、ZEB1以及ZEB2的蛋白表達水平明顯下降;.下調miR-223表達后,劃痕實驗和transwell實驗顯示AsPC-1 GR和PANC-1 GR細胞的遷移能力和侵襲能力下降;而細胞粘附和脫落實驗結果顯示,miR-223下調后能夠降低耐藥細胞的粘附和脫落能力;為了明確FBW7是否參與耐藥細胞EMT的調控,我們首先檢測耐藥細胞株和親本細胞株之間FBW7的表達差異,然后檢測耐藥細胞株在轉染miR-223抑制劑后對FBW7表達的影響,qRT-PCR和蛋白印跡結果顯示,AsPC-1GR和PANC-1 GR細胞中FBW7的mRNA和蛋白水平均低于其親本細胞;下調耐藥細胞株miR-223表達后,FBW7的mRNA和蛋白表達水平明顯高于其轉染對照序列組,說明miR-223下調可以明顯升高耐藥細胞株中FBW7的表達;利用蛋白印跡的方法又進一步檢測了FBW7的底物分子Notch1的表達,發(fā)現AsPC-1 GR和PANC-1 GR細胞株中Notch1表達要明顯高于其親本細胞,且在轉染mi R-223抑制劑后,Notch1的蛋白表達水平明顯低于其轉染對照序列的細胞,這些結果提示,耐藥細胞株EMT的過程可能與低表達的FBW7和高表達的Notch1有關;MTT結果顯示在AsPC-1 GR和PANC-1 GR細胞轉染miR-223抑制劑后,可以明顯增強對化療藥物吉西他濱的敏感性。3.大豆異黃酮對耐藥細胞株AsPC-1 GR和BxPC-3 GR細胞具有明顯的生長抑制的作用,具有濃度依賴性;大豆異黃酮可以顯著下調AsPC-1 GR和Bx PC-3 GR細胞株中miR-223的表達;顯微鏡下觀察到不管是miR-223抑制劑組,還是大豆異黃酮組,以及聯合應用組,細胞形態(tài)都由細長的間質細胞形態(tài)轉變?yōu)檩^短較圓的上皮細胞,而且聯合應用組對細胞形態(tài)的逆轉作用比單獨使用mi R-223抑制劑或是單獨使用大豆異黃酮都更為明顯;qRT-PCR和WB結果顯示,與對照組相比,其他3組中上皮細胞標志物E-caderin的表達升高,其中聯合應用組細胞中E-caderin的蛋白表達升高最為顯著,高于大豆異黃酮和miR-223抑制劑單獨處理組,而如Slug,Snail,ZEB1,ZEB2和Vimentin等蛋白的表達變化正好與E-caderin的趨勢相反;大豆異黃酮和miR-223抑制劑都可以升高FBW7的表達,降低Notch1的表達,而大豆異黃酮和miR-223抑制劑的聯合應用升高FBW7,降低Notch1蛋白水平的效果更為明顯,超過兩者單獨應用的效果;惡性生物學行為檢測結果顯示,大豆異黃酮、miR-223抑制劑、以及兩者聯合應用這3組對細胞遷移、侵襲、粘附和脫落的抑制程度都超過對照組細胞,其中聯合應用組最明顯,說明兩者聯合應用可以發(fā)揮協同抑制作用;大豆異黃酮和miR-223 inbibitor的聯合應用比起單獨應用能夠更有效的提高對化療藥物的敏感性。結論:人胰腺癌耐藥細胞株形態(tài)的改變、更強的遷移和侵襲能力、粘附和脫落能力、EMT標志物的變化結果都說明耐藥細胞株發(fā)生了EMT的轉化,提示人胰腺癌對吉西他濱的耐藥性可能與EMT的發(fā)生有關。miR-223在調控耐藥相關的EMT過程中發(fā)揮關鍵作用,下調miR-223的表達可以逆轉耐藥細胞EMT,降低耐藥細胞的遷移和侵襲、粘附和脫落能力,改善耐藥情況,提高耐藥細胞對化療藥物吉西他濱的療效。miR-223調控耐藥細胞的EMT可能與細胞中FBW7的下調,Notch1的上調有關。下調miR-223可能是臨床上治療胰腺癌,改善胰腺癌耐藥的一個潛在途徑。miR-223抑制劑和大豆異黃酮聯合應用,可以發(fā)揮協同作用,比起兩者的單獨應用,能夠更為有效的逆轉耐藥細胞的EMT,更為有效的抑制耐藥細胞的生長、轉移,更為有效的提高耐藥細胞對化療藥物的敏感性。因此,miR-223抑制劑和大豆異黃酮的聯合應用可能是一個潛在的治療胰腺癌的有效措施。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.9
【圖文】：

：AsPC-1 細胞和 AsPC-1 GR 細胞的 MTT 檢測，B：PANC-1 細胞和 PANC-1 GR 細胞MTT 檢測，C：BxPC-3 細胞和 BxPC-3 GR 細胞的 MTT 檢測圖 1-1 MTT 檢測人胰腺癌細胞及其耐藥細胞的活力

A：AsPC-1 細胞和 AsPC-1 GR 細胞的形態(tài)，B：PANC-1 細胞和 PANC-1 GR 細胞的形態(tài)，C：BxPC-3 細胞和 BxPC-3 GR 細胞的形態(tài)圖 1-2 顯微鏡下觀察人胰腺癌親本和耐藥細胞形態(tài)變化

MiR-223 調控胰腺癌細胞對吉西他，顯微鏡下觀察創(chuàng)傷大小并拍照。由實驗結果可知，細胞劃痕株的創(chuàng)傷面積明顯比親本細胞小（見圖 1-3）由此可見，吉西耐藥細胞表現出比其親本細胞更強的遷移能力。

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 ;Inhibitory effects of genistein on metastasis of human hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2009年39期

2 Hitoshi Iwamoto;;Genistein inhibits invasive potential of human hepatocellular carcinoma by altering cell cycle, apoptosis, and angiogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2005年41期

3 ;Apoptosis of human primary gastric carcinoma cells induced by genistein[J];World Journal of Gastroenterology;2004年12期

本文編號：2790140