【摘要】：目的:1.篩選腎透明細(xì)胞癌中差異表達(dá)的miRNA,驗(yàn)證miR-9-5p在腎透明細(xì)胞癌中低表達(dá)并鑒定其臨床價(jià)值。2.探索miR-9-5p對(duì)體外腎癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。3.預(yù)測(cè)miR-9-5p的作用靶點(diǎn)并初步探索其相關(guān)機(jī)制。4.探索miR-9-5p在腎透明細(xì)胞癌患者血清外泌體中的表達(dá)情況。方法:1.通過(guò)查閱文獻(xiàn)并篩選腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)差異的miRNA,運(yùn)用熒光qR T-PCR測(cè)定miR-9-5p在44對(duì)腎透明細(xì)胞癌組織及其癌旁組織、腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系786-O和SN12-PM6中的表達(dá)情況,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其臨床意義。2.構(gòu)建對(duì)照質(zhì)粒pFlag-cmv2及miR-9-5p表達(dá)質(zhì)粒phsa-miR-9,分別轉(zhuǎn)染786-O和SN12-PM6細(xì)胞,構(gòu)建高表達(dá)miR-9-5p的腎癌細(xì)胞模型,并通過(guò)qR TPCR分析其轉(zhuǎn)染后的表達(dá)情況。3.采用CCK8、transwell實(shí)驗(yàn)分析miR-9-5p上調(diào)后786-O細(xì)胞在增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力上的變化。4.通過(guò)Targetscan等多個(gè)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件篩選miR-9-5p的靶點(diǎn),預(yù)測(cè)其靶基因,應(yīng)用qR T-PCR、Western blot技術(shù)檢測(cè)所預(yù)測(cè)靶基因在腎透明細(xì)胞癌組織及其癌旁組織、轉(zhuǎn)染后的786-O和SN12-PM6細(xì)胞中的表達(dá)情況。5.通過(guò)超速離心法分離4例腎透明細(xì)胞癌患者和4例健康對(duì)照者的血清外泌體并以透射電子顯微鏡觀察,采用HiSeq深度測(cè)序檢測(cè)和分析外泌體中的miRNA表達(dá)譜,運(yùn)用生物信息技術(shù)分析miRNA表達(dá)譜。6.采用熒光q RT-PCR測(cè)定10例腎透明細(xì)胞癌患者和4例健康對(duì)照者的血清外泌體中miR-9-5p的表達(dá)情況。結(jié)果:1.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,高通量microarray分析腎透明細(xì)胞癌及其癌旁組織的miRNA表達(dá)譜結(jié)果顯示癌組織中miR-9-5p的表達(dá)下調(diào)7.6倍,且miR-9-5p在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)并具有一定的抑癌作用;qRT-PCR結(jié)果顯示miR-9-5p在93.2%(41/44)的腎透明細(xì)胞癌中明顯下調(diào)(p=0.00010.05),平均下調(diào)3.8倍,相對(duì)于癌旁正常組織,786-O和SN12-PM6細(xì)胞miR-9-5p的表達(dá)分別下調(diào)836.3倍和24.1倍;miR-9-5p的表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者的性別、年齡、腫瘤分期、分級(jí)、大小均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。2.轉(zhuǎn)染phsa-miR-9后的786-O和SN12-PM6細(xì)胞miR-9-5p的表達(dá)顯著提高,分別為21610.3倍和4599.5倍。3.上調(diào)miR-9-5p的表達(dá)后,786-O細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯受到抑制。4.靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件顯示CXCR4、NFκB1、FN1、Bcl-2的3’UTR上均分別有miR-9-5p種子序列的結(jié)合位點(diǎn),四者在腎透明細(xì)胞癌組織中的mR NA表達(dá)水平升高,分別為癌旁組織的71倍、5.8倍、19.3倍和9.7倍,對(duì)應(yīng)的蛋白水平表達(dá)也升高;CXCR4在高表達(dá)miR-9-5p的786-O和SN12-PM6細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)明顯。5.4例腎透明細(xì)胞癌患者和4例健康對(duì)照者的血清外泌體測(cè)序結(jié)果顯示miR-9-5p在腎透明細(xì)胞癌患者血清外泌體中表達(dá)上調(diào)。6.10例腎透明細(xì)胞癌患者和4例健康對(duì)照者的血清外泌體的qR T-PCR結(jié)果顯示miR-9-5p在腎透明細(xì)胞癌患者血清外泌體中表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:miR-9-5p在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào),其通過(guò)抑制腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑癌基因的作用;CXCR4可能是miR-9-5p發(fā)揮功能的直接作用靶點(diǎn),其在腎透明細(xì)胞癌組織中高表達(dá)可能是由于miR-9-5p的下調(diào)所致;腎透明細(xì)胞癌可能通過(guò)外泌體介導(dǎo)排出具有抑癌作用的miR-9-5p。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.11
【圖文】：

1644例中有41例癌組織表達(dá)低于癌旁正常組織，占93.2%（41/44），平均下調(diào)3.8倍。（圖1）相對(duì)于癌旁正常組織，786-O和SN12-PM6細(xì)胞miR-9-5p的表達(dá)分別下調(diào)836.3倍和24.1倍。（圖2）miRNA P-value Fold-changehsa-miR-141 4.11E-08 103.9907hsa-miR-200c 4.35E-06 99.78783hsa-miR-138 1.14E-06 22.829311hsa-miR-514 5.95E-04 18.36648hsa-miR-135a 0.037347153 13.173383hsa-miR-509-3p 3.74E-04 8.679166hsa-miR-9* 9.41E-04 8.520466hsa-miR-508-3p 0.003473291 7.8097095hsa-miR-124 0.004608731 7.624603hsa-miR-9 0.014416155 7.6159034表 1：文獻(xiàn)報(bào)道高通量microarray分析5對(duì)腎透明細(xì)胞癌及其癌旁組織的miRNA表達(dá)譜結(jié)果：癌組織中miR-9-5p表達(dá)下調(diào)7.6倍[18]。Table 1：Downregulation profle of miRNAs in 5 pairs of ccRCC and adjacent normaltissues，miR-9-5p was one of the remarkably downregulated miRNAs (7.6-fold)[18]圖 1：44對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者的癌組織及其癌旁正常組織miR-9-5p的相對(duì)表達(dá)情況Fig 1: Expression of miR-9-5p in 44 pairs of ccRCC specimens and adjacent normaltissues（***P＜0.001）

44例中有41例癌組織表達(dá)低于癌旁正常組織，占93.2%（41/44），平均下調(diào)3.8倍。（圖1）相對(duì)于癌旁正常組織，786-O和SN12-PM6細(xì)胞miR-9-5p的表達(dá)分別下調(diào)836.3倍和24.1倍。（圖2）miRNA P-value Fold-changehsa-miR-141 4.11E-08 103.9907hsa-miR-200c 4.35E-06 99.78783hsa-miR-138 1.14E-06 22.829311hsa-miR-514 5.95E-04 18.36648hsa-miR-135a 0.037347153 13.173383hsa-miR-509-3p 3.74E-04 8.679166hsa-miR-9* 9.41E-04 8.520466hsa-miR-508-3p 0.003473291 7.8097095hsa-miR-124 0.004608731 7.624603hsa-miR-9 0.014416155 7.6159034表 1：文獻(xiàn)報(bào)道高通量microarray分析5對(duì)腎透明細(xì)胞癌及其癌旁組織的miRNA表達(dá)譜結(jié)果：癌組織中miR-9-5p表達(dá)下調(diào)7.6倍[18]。Table 1：Downregulation profle of miRNAs in 5 pairs of ccRCC and adjacent normaltissues，miR-9-5p was one of the remarkably downregulated miRNAs (7.6-fold)[18]圖 1：44對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者的癌組織及其癌旁正常組織miR-9-5p的相對(duì)表達(dá)情況Fig 1: Expression of miR-9-5p in 44 pairs of ccRCC specimens and adjacent normaltissues（***P＜0.001）

3.2 miR-9-5p對(duì)腎透明細(xì)胞癌的臨床價(jià)值miR-9-5p的表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者的性別、年齡、腫瘤分期、分級(jí)、大小均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。（表2和圖3）n % Mean±SEM(Normalized)PGenderM 24 54.5 0.2347±0.08497W 20 45.5 0.2987±0.1827 0.7389Age≤50 15 34.1 0.1123±0.04939>50 29 65.9 0.3422±0.139 0.2511TNM stageT1 38 86.4 0.2919±0.1082 0.6197aT2 3 6.8 0.09682±0.06718 0.7897bT3 3 6.8 0.075±0.03669 0.5810cFuhrman classificationⅠ/Ⅱ 36 81.8 0.2808±0.1126Ⅲ/Ⅳ 8 18.2 0.1872±0.11 0.7057Tumor diame

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2788377