【摘要】：前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,隨著人口老齡化的加劇,前列腺癌的發(fā)病率和死亡率也逐年增高。前列腺癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移,且轉(zhuǎn)移后預(yù)后較差。在治療方面,早期前列腺癌主要以手術(shù)治療為主,若手術(shù)治療后復(fù)發(fā)或前列腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移,則以內(nèi)分泌治療為主。有研究表明早期雄激素剝奪治療對80%的患者敏感,此時大多為激素依賴性前列腺癌(androgen-dependent prostate cancer,ADPC),在經(jīng)過14-30個月的中位時間后,最終都發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC),此階段的前列腺癌對各種治療都不敏感,是晚期患者死亡的主要原因。現(xiàn)已有很多關(guān)于前列腺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移方面的研究,但其原因及機制目前仍未完全了解清楚。近年來,越來越多關(guān)于microRNA(miRNA)和腫瘤之間相關(guān)性的研究。miRNA是單鏈的非編碼小分子RNA,含有19-25個核苷酸,通過結(jié)合編碼基因的mRNA的3’非編碼區(qū)(3’UTR)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因表達,已有大量的研究表明miRNA和細胞的增殖、凋亡有著密不可分的關(guān)系。通過結(jié)合基因芯片技術(shù)、生物信息學技術(shù)和臨床相關(guān)性研究分析,我們發(fā)現(xiàn)miR-200a在ADPC和CRPC組織中的表達存在差異,CRPC組織中miR-200a相對ADPC組織顯著低表達。miR-200a是miR-200家族中的一員,在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)miR-200a表達異常,但是miR-200a與前列腺癌關(guān)系的研究目前僅國外有少數(shù)報道,故本研究首先通過實時熒光定量PCR技術(shù)在前列腺癌的組織中驗證miR-200a的表達水平,并且通過miR-200a表達失調(diào)的體外功能實驗,探究miR-200a在前列腺癌中的生物學功能。最后通過Agilent(人類)表達譜芯片檢測和預(yù)測網(wǎng)站相結(jié)合的辦法進一步探究miR-200a潛在的下游靶基因并進行驗證,為篩選前列腺癌的生物標志物以及今后尋找新的前列腺癌治療靶點奠定堅實的理論基礎(chǔ)。第一部分miR 200a在前列腺癌組織中的表達差異目的:前列腺癌的發(fā)生是一個很復(fù)雜的過程,涉及到許多不同的基因。為了尋找可能影響前列腺癌發(fā)生發(fā)展的miRNA,本階段研究通過miRNAs芯片表達譜檢測分析在ADPC患者組織標本與CRPC癌患者組織標本中顯著差異性表達的miRNA,結(jié)合文獻選取有研究意義的miRNA,并予以驗證。方法:臨床收集8例ADPC組織與6例CRPC組織在液氮中保存,取3例ADPC組織與3例CRPC組織進行miRNAs表達譜芯片檢測分析,結(jié)合文獻尋找有研究意義的miRNA,并且進行實時熒光定量PCR(q RT-PCR)實驗,在組織標本中驗證其表達量。同時,下載美國紀念斯隆凱瑟琳癌癥研究中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center,MSKCC)數(shù)據(jù)庫中前列腺癌患者的miRNA表達基因芯片數(shù)據(jù),利用統(tǒng)計學的方法分析差異表達的miRNA在前列腺癌中的診斷作用以及與前列腺癌生化復(fù)發(fā)的關(guān)系。結(jié)果:miRNA表達譜芯片檢測分析發(fā)現(xiàn)在ADPC與CRPC組織中miR-200a的表達存在顯著差異。miR-200a在惡性程度較高的CRPC組織中與ADPC組織相比顯著低表達,并且在前列腺癌組織標本中進行q RT-PCR實驗同樣驗證了這一點(P0.001)。同時,對MSKCC數(shù)據(jù)庫中下載的前列腺癌患者資料進行二次分析,以中位數(shù)為截點將前列腺癌組分為miR-200a高表達組和miR-200a低表達組進行Kaplan Meier分析,結(jié)果顯示miR-200a低表達組的患者生化復(fù)發(fā)時間似乎比miR-200a高表達組短,但是無統(tǒng)計學差異(P0.05)。通過多因素COX回歸分析得出miR-200a是影響前列腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素。結(jié)論:通過研究結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)miR-200a在CRPC中的表達較ADPC中顯著降低,并且miR-200a能夠用于輔助診斷前列腺癌的惡性進展。第二部分miR 200a對前列腺癌細胞生物學功能的影響及機制初探目的:在第一部分中,我們通過miRNA芯片表達譜分析結(jié)合q RT-PCR驗證了miR-200a在CRPC組織中顯著低表達,并且miR-200a是影響前列腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素。為了進一步探究miR-200a可能對前列腺癌細胞的生物學功能造成哪些影響以及產(chǎn)生影響的機制,本部分研究采用過表達前列腺癌細胞中miR-200a的方法,進行凋亡、侵襲、遷移和平板細胞克隆形成等實驗,研究分析miR-200a對前列腺癌細胞生物學功能的影響并尋找miR-200a的下游靶基因,進一步了解miR-200a和前列腺癌之間的關(guān)系。方法:分別在兩種雄激素非依賴性前列腺癌細胞(DU145、PC3)中過表達miR-200a,將過表達組與陰性對照組進行MTT實驗和低密度細胞集落形成實驗實驗,觀察miR-200a對前列腺癌細胞增殖的影響;Transwell小室侵襲和遷移實驗觀察miR-200a對前列腺癌細胞侵襲和遷移的影響;進行凋亡實驗并使用流式細胞技術(shù)檢測凋亡率,觀察miR-200a對前列腺癌細胞凋亡的影響。使用Agilent(人類)表達譜芯片檢測和miRNA靶基因分析和預(yù)測軟件(miRNADA、Target Scan、Array、Diana)篩選miR-200a的潛在下游靶基因,并通過Western Blot實驗和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬眚炞C。結(jié)果通過SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析處理。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:MTT細胞增殖實驗和低密度細胞集落形成實驗均表明過表達miR-200a組細胞和陰性對照組(negative control組)相比,過表達組能夠顯著抑制前列腺癌細胞的增殖能力(P0.05);Transwell小室實驗表明過表達miR-200a后前列腺癌細胞的侵襲和遷移能力明顯降低(P0.05);使用流式細胞儀進行凋亡檢測發(fā)現(xiàn)過表達miR-200a后能增加前列腺癌細胞的凋亡率(P0.05)。通過Agilent(人類)表達譜芯片檢測和miRNA靶基因分析和預(yù)測軟件結(jié)合的方法,我們發(fā)現(xiàn)溴樣結(jié)構(gòu)域蛋白4(BRD4)是miR-200a的潛在下游靶基因,并且Western Blot實驗和熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了miR-200a可以結(jié)合到BRD4的3’UTR區(qū)使得BRD4蛋白的表達量下降(P0.05)。結(jié)論:試驗證明了過表達miR-200a后,前列腺癌細胞的侵襲、遷移及增殖能力均受到抑制,并能促進前列腺癌細胞凋亡,故能得出結(jié)論,miR-200a在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中扮演的是抑癌基因的角色,并且BRD4是miR-200a的潛在下游靶基因,miR-200a可能通過靶向BRD4來影響前列腺癌細胞的生物功能。
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.25
【圖文】：

圖 1.1 excel 表格表示 miRNA 在 ADPC 組織和 CRPC 組織中的差異表達隨機選取液氮中保存的 3 例 ADPC 組織和 3 例 CRPC 組織，采用 AgilentmiRNAs 表達譜芯片，委托上海吉凱生物公司進行實驗操作和數(shù)據(jù)分析。檢測結(jié)果顯示 miR-200a 在 CRPC 中與 ADPC 相比明顯降低。2.miR-200a 與前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)時間的關(guān)系

表明 miR-200a 在 CRPC 組織中的表達低于與 A 1.1 excel 表格表示 miRNA 在 ADPC 組織和 CRPC 組織中的差異取液氮中保存的 3 例 ADPC 組織和 3 例 CRPC 組織，譜芯片，委托上海吉凱生物公司進行實驗操作和數(shù)據(jù)200a 在 CRPC 中與 ADPC 相比明顯降低。a 與前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)時間的關(guān)系

T-PCR 驗證 miR-200a 在 ADPC 組織和 CRPC 組織中將剩余的前列腺癌標本進行熒光定量 PCR 組織中的表達和 ADPC 中相比明顯降低，中扮演的是抑癌基因的角色（P < 0.001）。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 韓蘇軍;張思維;陳萬青;李長嶺;;中國前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢分析[J];臨床腫瘤學雜志;2013年04期

本文編號：2777645